Universidad austral de chile

Nota: seleccionar el transductor de baja capacidad (5Kg) e instalar en el soporte, presione la tecla Transducer y seleccionar el transductor instalado

a) Ajustar el soporte para acoplar el pasador. Este pasador es requerido para sostener el peso de calibración en transductores de baja capacidad y su peso debe ser incluido para el balance inicial.

b) Presione la tecla Calibrate. Aparece la siguiente pantalla

c) Si el valor de la pantalla no es cero, ajustar

1. Liberar los controles de balance Fine y Coarse, girando cada perilla hacia la izquierda.

2. Ajustar los controles para obtener la lectura 0

3. Fijar los controles de balance Fine y Coarse.

d) Presionar la tecla Calibrate dos veces y verificar que las unidades de carga están en la zona de datos de la pantalla.

e) Verificar que el rango de carga esté puesto en el valor de máxima capacidad del transductor instalado (5.000 g). Si este rango es incorrecto, presionar la tecla Load Range sucesivamente hasta que aparezca el valor buscado, luego presionar Enter para seleccionar dicho valor.

f) La lectura de carga en la zona de datos debe indicar una lectura entre 0 y 5% de la máxima capacidad de la carga del transductor.

g) Si la lectura es mayor, ajustar la posición del centro del LVDT (soporte)

1. Inserte atornillador de paleta dentro del orificio superior del LVDT.

2. Ajustar el centro del LVDT por rotación hasta que el valor sea obtenido.

Calibración del Transductor de baja capacidad (5 Kg = 5.000 g)

a) Presionar la tecla Load Range hasta que el valor que aparece corresponda al 20% de la capacidad del transductor (1.000 g), luego presionar Enter para su selección.

b) Poner en 0 la lectura de carga en la zona de datos

1. Liberar los controles de balance Fine y Coarse.

2. Ajustar los controles para obtener la lectura 0.

3. Fijar los controles Fine y Coarse.

c) Seleccionar el peso de calibración (500 g) y cuelgue el peso en el soporte acoplado.

d) Gire el tornillo Adjust del panel frontal hasta que la lectura de carga coincida con el valor (500 g).

e) Antes de realizar la lectura seleccione en el panel el modo Tensile.

f) Acople el dispositivo necesario (penetrómetro de 1,5 cm de diámetro)

g) Seleccione la velocidad (Speed) de 2 mm/s.

h) Ajustar la altura de medición (2 cm de profundidad)

i) Realizar la medición.

Parte 2: Técnica utilizada según STORRY y FORD (1982b) modificado.

Preparación de la muestra

1) Temperar 100 mL de leche a 35°C en un vaso precipitado de 5 cm de altura y mantener en baño maría termoregulado (35°C).

2) Agregar 5 mL de extracto enzimático vegetal con agitación por 30 s.

3) Dejar reposar en el baño durante 30 min.

Una vez realizada la calibración del equipo, seleccionar la velocidad (2 mm/s) y realizar la lectura a 2 cm de profundidad en el centro de la cuajada o gel, en el modo tensión.

• 
  Solución A: Acrilamida BIS
  
• 
  Solución B: 1,5 Tris-HCl pH 8,8
  
• 
  Solución C: 0,5 Tris-HCl pH 6,8
  
• 
  SDS 10%
  
• 
  Persulfato de amonio 1%
  
• 
  Temed
  
• 
  Buffer Electrodos pH 8,3 (tris, glicina, SDS, agua destilada)
  
• 
  Buffer Muestra (Solución C, glicerol 87%, SDS 10%, β mercaptoetanol 13M, azul de bromofenol 0,05%, agua destilada)
  
• 
  Reactivos de Fijación y Tinción: Coomasie 0,25 g en 300 mL Isopropanol-Acido acético-Agua. Proporción: 2,5:1:2,5.
  
• 
  Reactivo Decolorante (ácido acético 7%)
  

• 
  Preparar los geles y montar el sistema.
  
• 
  Colocar 15 μL de las muestras del extracto enzimático vegetal y 4 μL del estándar de peso molecular.
  
• 
  Dejar hasta que el frente iónico llegue prácticamente hasta abajo, aproximadamente esto ocurre a los 70 minutos.
  
• 
  Sacar el gel del vidrio. Teñir y Fijar por 3 horas
  
• 
  Decolorar por 12 horas.
  
• 
  Medir la migración de las bandas con pie de metro
  

Anexo 9. Método cromatográfico, propuesto por IDF/FIL 110A: 1987.

• 
  Agitar celulosa por 30 min en 0,5 N HCl (15 g de celulosa en 225 mL de HCl)
  
• 
  Filtrar y lavar con vidrio fritado con agua hasta que el pH del efluente sea cercano a 4,0.
  
• 
  Agitar la resina filtrada por 30 min en 0,5 N NaOH (15 g en 225 mL).
  
• 
  Filtrar y lavar con vidrio fritado con agua hasta que el pH del efluente sea cercano a 7,0.
  
• 
  Agitar la celulosa (resina filtrada) por 30 min en NaCl 25% (15 g en 225 mL).
  
• 
  Filtrar y lavar con vidrio fritado con agua hasta que el pH del efluente sea cercano a 6,0.
  
• 
  Lavar con Buffer piperazina 0,025 M hasta que el pH sea de 5,3, guardar a 4°C.
  

• 
  Determinar tiempo de coagulación y fuerza de cuajo de la muestra.
  
• 
  Sumergir bolsas de diálisis por 5 min en agua hirviendo y lavar con agua destilada por dentro y por fuera.
  
• 
  Dializar 5 mL de cuajo contra 250 mL de Buffer piperazina por 150 min.
  
• 
  Agitar con agitador magnético.
  
• 
  Determinar tiempo de coagulación y fuerza de cuajo dializada.
  

• 
  Colocar DEAE-celulosa en la columna hasta una altura mínima de 9 cm.
  
• 
  Una vez que la resina se ha asentado, se agrega la enzima y los Buffer correspondientes al procedimiento señalado por la FIL-IDF, tomando fracciones cada 5 y 10 mL.
  

• 
  Pesar 10 g de muestra y agregar 80 mL de agua destilada.
  
• 
  Llevar a pH 3-3 con HCl 10%.
  
• 
  Extraer en un embudo de separación con 40 Ml de Eter: Cloroformo (20: 80).
  
• 
  Agitar 15 minutos a baja velocidad. Realizar a lo menos 2 extracciones.
  
• 
  Las fases orgánicas se filtran y se colocan en cápsula de vidrio.
  
• 
  Los solventes se evaporan por calentamiento suave en un baño María (60-70 °C).
  
• 
  El residuo del extracto ácido se disuelve con varias gotas de acetona.
  
• 
  Se siembra la muestra y junto a un patrón de posible pesticida (20 μL de cada uno) en una placa.
  
• 
  Se realiza la CCF.
  
• 
  La cámara cromatográfica se satura con una mezcla de 50 mL de Etanol: Eter Acido Acético glacial (85 : 15 : 1) por 30 minutos.
  
• 
  La placa se introduce en la cámara y se deja 1 hora.
  
• 
  Se sacan las placas y se dejan secar unos minutos.
  
• 
  La placa es rociada por pulverización de una solución de Difenilamina 0,1% en Etanol.
  
• 
  Revelado bajo luz ultravioleta de onda larga.
  

• 
  Pesar 25 g de muestra.
  
• 
  Depositar en un vaso de mezcladora.
  
• 
  Anadir 10 g de tierra para filtrado y 75 mL de acetonitrilo al 80%.
  
• 
  Cubrir la boca del vaso con parafilm y sellar con su tapa.
  
• 
  Mezclar por 3 minutos a alta velocidad.
  
• 
  Filtrar a través de un papel filtro y recoger 25 mL del filtrado.
  
• 
  Añadir 10 mL de acetato de plomo 20% y 65 mL de agua destilada .
  
• 
  Esperar 3 minutos para la floculación del precipitado.
  
• 
  Añadir 10 g de tierra de filtrado y revolver.
  
• 
  Filtrar y recoger 50 mL.
  
• 
  Trasvasijar a un embudo de separación y agregar 1,5 mL Benceno: Acetonirilo (98:2).
  
• 
  Mezclar por 30 segundos, ventilando para que el gas escape.
  
• 
  Dejar reposar 3 minutos para que las capas se separen.
  
• 
  Descartar la fase inferior (fase acuosa).
  
• 
  Añadir 25 mL de agua destilada a la fase orgánica y revolver suavemente.
  
• 
  Después que las fases se han separado, drenar y descartar la fase inferior.
  
• 
  Recoger la capa superior (benceno) en un tubo de ensayo que contenga una pequeña cantidad (la punta de un espátula) de sulfato sódico anhidro y tapar herméticamente.
  
• 
  Esperar 1-2 horas y proceder por CCF.
  
• 
  El revelado se realiza bajo luz ultravioleta de onda larga.
  

Anexo 11. Contenido de proteínas según AÑON y MARTINEZ (1996), método de LOWRY et al. (1951).

Anexo 12. Contenido de proteínas según GUPTA y ESKIN (1977), método de LOWRY et al. (1951).

Anexo 13. Temperatura y pH óptimo del extracto enzimático vegetal.

Anexo 14. Resultados de los análisis efectuados a la planta y al extracto enzimático vegetal.