Universidad austral de chile

5. CONCLUSIONES

• 
  Se logró extraer enzimas proteásicas a partir de la planta Ulex europaeus.
  
• 
  Los mejores resultados para conseguir un extracto enzimático de origen vegetal, se obtuvieron con la preparación molida en forma manual, utilizando la extracción sugerida por GUPTA y ESKIN (1977). La temperatura y pH óptimo determinado para éste extracto corresponden a 30°C y 5,5, respectivamente.
  
• 
  Los cambios climáticos presentes en las fechas de recolección de las muestras incidieron directamente en el contenido de humedad de la planta, ya que las fechas de muestreos con promedios más elevados de humedad, corresponden a su vez a períodos de lluvias en la zona de recolección.
  
• 
  Con respecto al porcentaje de proteína en la planta Ulex europaeus, éste fue levemente inferior a lo señalado por diversos autores, tanto para la misma planta como para otras especies forrajeras (tales como Auxemma oncocalyx, Bauhinia, Caesalpinia bracteosa, Mimosa caesalpinifolia, Mimosa hostiles, Zyziphus joazeiro).
  
• 
  El contenido de proteínas en el extracto enzimático de origen vegetal está directamente relacionado con la fuerza de cuajo, tiempo de coagulación, sinéresis y fuerza del gel obtenido, ya que a medida que aumenta la cantidad de proteínas, mejoran estas propiedades de coagulación. Además, si bien se obtuvieron resultados positivos en relación a éstas pruebas, no se logró igualar al cuajo estándar utilizado como referencia.
  
• 
  La electroforesis aplicada indicó que en el extracto enzimático de origen vegetal están presentes 3 proteínas principales cuyos pesos moleculares corresponden a 60, 42 y 17 KDa. Por otra parte, a través de cromatografía se visualizó una buena posibilidad de concentrar la enzima y mejorar los resultados, lo que habría que probar en estudios futuros.
  
• 
  Los análisis toxicológicos indicaron que no hay presencia de pesticidas organoclorados ni aflatoxinas en la planta utilizada en la elaboración del extracto enzimático obtenido de la planta Ulex europaeus.
  

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ANEXOS

Anexo 1. Esquema de ubicación de la zona de muestreo, sector Niebla, Valdivia.

Esquema de la zona de muestreo

Anexo 2. Determinación del contenido de humedad según el método de la AOAC 934.01 (2000).

Anexo 3. Determinación de proteínas en la planta, según AOAC 978.04 (modificado).

• 
  Se agregan las tabletas Kjeldahl al tubo de digestión limpio y seco, además de 1 g de muestra lo más cercano a 0,001 g.
  
• 
  Luego agregar 10 mL de H₂SO₄ concentrado y 3 gotas del ageste antiespumante, mezclando en forma suave.
  
• 
  Se deja reposar 5 min.
  
• 
  Se agregan 5 mL de H₂O₂ por las paredes del tubo.
  
• 
  Se mezcla suavemente y se deja reposar 10 a 15 min.
  

• 
  Se coloca el tubo de digestión en el digestor de bloque. Colocando además la tapa provista del sistema de extracción.
  
• 
  Digerir la muestra por 40 min. y luego enfriar el tubo.
  
• 
  Sacar la tapa extractora y agregar a cada tubo 50 mL de agua destilada.
  

• 
  Transferir el tubo a la unidad de destilación y colocar un matraz erlenmeyer con 50 mL de ácido bórico y 0,2 mL de solución indicadora bajo la salida del condensador, de tal manera que el tubo de descarga esté sumergido en la solución de ácido bórico.
  
• 
  Ajustar el dispensador de la unidad de destilación para escurrir 35 mL de NaOH.
  
• 
  Luego dejar destilar la muestra.
  

Se titula el destilado con una solución de ácido estándar en buretas frente aun comparador preparado con agua destilada, 50 mL de ácido bórico y 0,2 mL del indicador.

Al mismo tiempo que se digieren las muestras, se debe digiere una muestra en blanco que contiene 2 mL de agua destilada y aprox. 0,25 g de sacarosa.

Anexo 4. Determinación del contenido de proteínas, de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951).

• 
  Solución A: Na₂CO₃ 2% P/V disuelto en NaOH 0,1N.
  
• 
  Solución B: CuSO₄ x 5 H₂O al 1% P/V y Tartrato de Na y K al 2% P/V. Mezclar en volúmenes iguales al momento de usar.
  
• 
  Solución C: mezclar solución A y B en proporciones 50: 1.
  
• 
  Solución E: reactivo Folin- Ciocalteau 1N.
  
• 
  Espectrofotómetro
  
• 
  Jeringa Hamilton 100μL.
  
• 
  Pipetas 0,5 y 1,0 mL.
  

• 
  Se miden 0,6 mL del extracto enzimático
  
• 
  Se agrega a cada tubo 3 mL de solución C y se deja a temperatura ambiente por 10 min.
  
• 
  Se agrega 0,3 mL de la solución E.
  
• 
  Se deja 30 min. a temperatura ambiente.
  
• 
  Se mide la absorbancia a 750 nm.
  

Extractado de CASANOVA, M. 2001. Identificación de las variantes genéticas de K- caseína en leche de vaca Holstein - Fresian y Jersey por electroforesis de Isoenfoque. Tesis Ingeniería en Alimentos. Valdivia. Universidad Austral de Chile. Facultad de Ciencias Agrarias. 102 p.

Curva de calibración para la determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951).

Preparación de la curva estándar.

• 
  Solución patrón: Seroalbúmina de bovino (BSA) 2 mg/mL.
  
• 
  Agregar a tubos de ensayo solución BSA en cantidades de 10, 20, 30, 40, 50, y 60 μL (20, 40, 60, 80, 100 y 120 μg de proteína) y completar con agua destilada hasta completar 0,6 mL.
  
• 
  Se agrega a cada tubo 3 mL de solución C y se deja a temperatura ambiente por 10 min.
  
• 
  Se agrega 0,3 mL de reactivo Folin-Ciocalteau 1N.
  
• 
  Se deja 30 min. a temperatura ambiente.
  
• 
  Se mide absorbancia a 750 nm.
  
• 
  Se grafica μg de proteína v/s D.O. 750 nm.
  

Curva de calibración obtenida de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951).

Anexo 5. Determinación del poder coagulante o fuerza del cuajo (ALAIS, 1985).

Un tarro de diámetro aproximado 10-10,5 cm. con un orificio de 1 mm. de diámetro, ubicado en el centro de la parte inferior del tarro.

• 
  Se toman 500 mL de leche cruda y se le agrega 0,1 g de CaCl₂ .
  
• 
  Se calienta a 30 - 31°C .
  
• 
  Se toman 100 mL de leche a 30°C y se colocan en el tarro con el orificio inferior tapado.
  
• 
  Se agregan 5 mL de la solución cuajo y se agita la leche
  
• 
  Se deja escurrir la leche por el orificio hasta que el goteo se detenga
  
• 
  Se toma el tiempo (en segundos) desde que se comienza a agregar la solución con el cuajo hasta que cae la última gota.
  

Anexo 6. Determinación del tiempo de coagulación de la enzima según el método propuesto por IDF/FIL 110 A Appendix A (1987).

Pesar 12 ± 0,02 g de leche en polvo descremada de bajo tratamiento térmico en un vaso precipitado de 250 mL. Pesar 100 ± 0,1 g de solución de Cloruro de calcio 0,01 M en un vaso precipitado de 150 mL. Vaciar alrededor de 10 mL del cloruro de calcio en un vaso que contiene la leche en polvo, agitar manualmente para obtener una mezcla homogénea y agregar el resto del cloruro de calcio. Agitar con agitador magnético por 30 min. No agitar vigorosamente para prevenir la formación de espuma. El pH de este sustrato es de alrededor de 6,35. No ajustar el pH.

Detener la agitación y dejar el sustrato a temperatura ambiente y en oscuridad por 30 min. El sustrato está ahora listo para ser usado, y puede mantenerse por 6 horas en un lugar oscuro a temperatura ambiente (16-22°C).

Coagulación del sustrato por la enzima

Agitar el sustrato por algunos segundos, entonces con una pipeta colocar 10 ± 0,01 mL del sustrato en tubos de ensayo.

Colocar los tubos en un baño maría termoregulado a 30 ± 0,05°C cuidando sumergir por completo la porción del tubo que contiene el sustrato.

Los tubos de ensayo permanecerán sumergidos en el baño por al menos 30 min y no más de 90 min.

Con una pipeta agregar 5 mL de la solución de enzima. Esta operación corresponde al punto de partida del test (tiempo cero). Mezclar la enzima y el sustrato manualmente de inmediato.

Anotar el tiempo de floculación del sustrato (formación de flóculos en la pared del tubo).

Anexo 7. Determinación de la fuerza del gel, en equipo INSTRON 1011, de acuerdo al método STORRY y GRAEME (1981). Referencia: CORTEZ (2002).