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3.5. Metodologías aplicadas


Una vez establecida la extracción que entregó los mejores resultados, y conociéndose además la temperatura y pH óptimo para el extracto enzimático de origen vegetal, se procedió a realizar dicha extracción, según la metodología descrita por GUPTA y ESKIN (1977), para realizar los análisis correspondientes para cada muestreo. Cabe señalar que cada análisis se realizó a lo menos en duplicado.

3.5.1. Determinación del contenido de humedad de la planta. Este procedimiento se realizó según lo descrito por la A.O.A.C. Official Method 934.01 (ANEXO 2) que se basa en la pérdida de humedad por medio de aire caliente en circulación. La preparación de la muestra consistió en cortar la planta extraída del suelo con una tijera pequeña usada en jardinería.

3.5.2. Determinación del porcentaje de proteínas de la planta. Se desarrolló según el método de semi micro Kjeldahl, obtenido de la AOAC 978.04 (ANEXO 3). Esta determinación tiene como principio la digestión de una porción de muestra usando un equipo de digestión en bloques, con una mezcla de ácido sulfúrico, peróxido de hidrógeno y sulfato de potasio, junto a un catalizador para convertir el nitrógeno orgánico presente a sulfato de amonio. Luego se adiciona un exceso de NaOH al digerido enfriado, a fin de liberar amonio. La destilación de la muestra digerida puede ser por destilación automática, semiautomática o manual. En el caso de las dos últimas, el amonio se recolecta en un exceso de ácido bórico y se titula con ácido sulfúrico.

Con respecto a la preparación de la muestra, esta consistió en la utilización de las hojas y tallos de la planta prepicadas, las cuales fueron molidas manualmente con la ayuda de un mortero.



3.5.3. Determinación del contenido de proteínas del extracto enzimático de origen vegetal. Se determinó de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951), que tiene como principio el desarrollo del color debido a la reacción de los enlaces peptídicos de los aminoácidos aromáticos de las proteínas y del cobre alcalino de uno de los reactivos, y a la reducción del fosfomolibdato – fosfotungsteno del reactivo Folin – Ciocalteau, (ANEXO 4).

3.5.4. Determinación de la fuerza de cuajo del extracto enzimático de origen vegetal. Se aplicó el método propuesto por ALAIS (1985) modificado en la temperatura (ANEXO 5). Este método se define como los litros de leche, a la cual se le ha adicionado cloruro de calcio, que es capaz de coagular 1 g de cuajo en un tiempo de 40 minutos a una temperatura dada. Este procedimiento consiste en agregar leche a un “vaso”, previamente graduado, para luego adicionar el cuagulante y dejar escurrir la leche por un orificio que posee en el fondo. Una vez coagulada la leche se detiene el flujo de leche (ALAIS, 1985 y FAO, 1980). Para la prueba se utilizó leche cruda proporcionada por el Fundo Teja Norte de la Universidad Austral de Chile.

3.5.5. Determinación del tiempo de coagulación del extracto enzimático de origen vegetal. Se utilizó el método propuesto por IDF/FIL 110 A Appendix A (IDF/FIL, 1987a), que se basa en el tiempo que transcurre en aparecer los primeros flóculos, desde el momento que se agrega la enzima coagulante, en las paredes de un tubo que contiene sustrato Berridge (leche en polvo descremada de bajo tratamiento térmico disueltas en cloruro de calcio 0,01 M) (ANEXO 6).

3.5.6. Determinación de la sinéresis del gel obtenido. Se aplicó el método sugerido por MARSHALL (1981), modificado por CORTEZ (2002), el cual consiste en medir cuantitativamente el volumen de suero, en una alícuota de 50 ml de leche a 30ºC (para el caso de este cuajo) en baño María, a la cual se le adiciona 2,5 mL de enzima coagulante con agitación por 30 segundos. Después de 30 minutos se corta la cuajada en forma de cruz y luego de 10 minutos se cuantifica el suero liberado por medio de una probeta.

3.5.7. Determinación de la fuerza del gel obtenido. Se realizó según el método descrito por STORRY y GRAEME (1981), modificado por CORTEZ (2002) (ANEXO 7), que tiene como principio el medir la resistencia de la cuajada ante la presión mecánica, para así determinar su firmeza.

La cuajada fue preparada con 100 mL de leche cruda, a una temperatura de 30°C, adicionándole 0,02 g de cloruro de calcio, y utilizando 5 mL de extracto enzimático vegetal.



3.5.8. Electroforesis del extracto enzimático de origen vegetal. Se realizó de acuerdo al método descrito por LAEMMLI (1970), el cual fue modificado, ya que para este caso se utilizaron placas para preparar los geles en lugar de tubos (ANEXO 8). Con respecto al principio del método, éste se basa en el uso de sistemas discontinuos en geles en presencia de SDS, y además que la separación de proteínas es independiente de la carga y depende sólo del tamaño.

3.5.9. Cromatografía en columna. Se utilizó el procedimiento propuesto por la IDF/FIL 110 A (IDF/FIL,1987b) (ANEXO 9). Esta cromatografía se basa en la separación de enzimas previamente dializadas, presentes en una muestra de cuajo, por medio de sucesivos lavados con dos tipos distintos de buffer en una columna de DEAE celulosa, para posteriormente, a las fracciones obtenidas, realizarles pruebas de actividad por medio de determinación del tiempo de coagulación (FIL/IDF, 1987b),

3.5.10. Análisis de toxicidad. Se realizaron análisis de pesticidas organoclorados y aflatoxinas a la preparación 3 de U. europaeus, señalado por la AOAC Official Method 970.52 y 975.35 (AOAC, 1995), modificado por el Laboratorio de Toxicología, del Instituto de Farmacología, de la Facultad de Ciencias Veterinarias, de la Universidad Austral de Chile (ANEXO 10).

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1. Ensayos preliminares


A continuación se presentan los resultados de los análisis destinados a encontrar una metodología de extracción con la cual obtener un extracto enzimático de origen vegetal, con el que se obtengan los mejores resultados, tanto para contenido de proteínas, fuerza de cuajo y tiempo de coagulación.

4.1.1. Resultados de la extracción según AÑON y MARTINEZ (1996). Se presentan los resultados obtenidos de los análisis del contenido de proteínas, fuerza de cuajo y tiempo de coagulación para extractos enzimáticos vegetales elaborados con las preparaciones 1 (a, b y c), 2 y 3 de U. europaeus.

4.1.1.1. Determinación del contenido de proteínas. El CUADRO 4 muestra que al trabajar con la preparación 1b se obtiene un promedio de 0,974 mg de proteína por mL de extracto enzimático, resultado levemente superior a la preparación 1a, con un 0,938 mg/mL (ANEXO 11). Estos resultados concuerdan con lo señalado por ORDOÑEZ (1995), que demuestra que mediante la utilización de buffer fosfato 0,08M, pH 6,5 se puede aumentar el contenido de proteínas de una preparación y así su posible acción enzimática.

Por otra parte, se observa un mayor aumento en el contenido de proteínas con la preparación 1c, con un promedio del 0,977 mg/mL, al utilizar buffer acetato 0,01M pH 5,5 en el proceso de extracción, como se ha hecho en otros estudios anteriores relacionados con extracciones enzimáticas de origen vegetal (GUPTA y ESKIN, 1977).

CUADRO 4. Contenido de proteínas en el extracto, según AÑON y MARTINEZ (1996).

Preparaciones



1a

0,938 ± 0,015

1b

0,974 ± 0,010

1c

0,977 ± 0,006

2

0,728 ± 0,020

3

1,268 ± 0,029

* Promedio de triplicados.

Finalmente, para el caso de las preparaciones 2 y 3, los resultados de las extracciones señalan un aumento del contenido de proteínas con la preparación 3, obteniéndose un promedio de 1,268 mg/mL (ANEXO 11), la cual es notoriamente mayor a las restantes preparaciones, lo que indica que al tratar la planta como se señala en éste procedimiento de extracción enzimática, es decir moliendo la planta en forma manual y utilizando buffer acetato para la suspensión de la planta y siguientes procedimientos de extracción, se obtienen los mayores resultados en cuanto al contenido de proteínas presenten en la preparación enzimática de origen vegetal.



4.1.1.2. Determinación de la fuerza de cuajo y tiempo de coagulación. En el caso de la determinación de la fuerza de cuajo y tiempo de coagulación no se obtienen resultados positivos en la extracción según AÑON y MARTINEZ (1996), utilizando las preparaciones 1a, 1b, 1c, 2 y 3.

4.1.2. Resultados de la extracción según GUPTA y ESKIN (1977). Se presentan a continuación los resultados del contenido de proteínas, fuerza de cuajo y tiempo de coagulación utilizando las extracciones obtenidas según la metodología de propuesta por GUPTA y ESKIN (1977).

4.1.2.1. Determinación del contenido de proteínas. El CUADRO 5 resume el contenido de proteínas de los extractos enzimáticos elaborados con las preparaciones 1c, 2 y 3 para este método de extracción. Claramente en la preparación 3 se encuentra una mayor cantidad de proteínas por mL, con 1,428 mg/mL, contra un 1,091 y 0,895 para las preparaciones 1 y 2, respectivamente (ANEXO 12).

CUADRO 5. Contenido de proteínas en el extracto, según GUPTA y ESKIN (1977).



Preparaciones



Preparación 1c

1,091 ± 0,010

Preparación 2

0,895 ± 0,010

Preparación 3

1,428 ± 0,015

* Promedio de triplicados.

4.1.2.2. Determinación de la fuerza de cuajo y tiempo de coagulación. A continuación se señalan los resultados de las pruebas de coagulación utilizando las tres diferentes preparaciones.

En el CUADRO 6 se muestran los resultados obtenidos para la fuerza de cuajo y tiempo de coagulación con las preparaciones 2 y 3, ya que con la preparación 1 no se obtienen resultados para estas pruebas de coagulación, en donde se observa que con la preparación 3 se obtienen los mejores resultados, ya que como promedio para la fuerza de cuajo se alcanza los 1:1.696 g/mL, es decir, que 1 g de solución enzimática es capaz de coagular 1,7 litros de leche a 35°C, lo que es casi 3 veces mayor a lo obtenido con la preparación 2 (1:580 g/mL). Además, para el caso del tiempo de coagulación, éste disminuye casi 1,5 veces desde 1.028 a 730 s de la preparación 2 a la 3.

CUADRO 6. Fuerza de cuajo y tiempo de coagulación en el extracto, según GUPTA y ESKIN (1977).




Repet.

Preparación 2

Preparación 3

Fuerza de cuajo (g/mL)

1

1 : 581,1

1 : 1.702,1

2

1 : 579,6

1 : 1.687,8

3

1 : 580,6

1 : 1.698,5



1:580,43 ± 0,764

1:1.696,13 ± 7,438

Tiempo de coag. (s)

1

1.030

731

2

1.027

728

3

1.028

732



1.028,33 ± 1,528

730,33 ± 2,082

Uno de los motivos de no encontrar buenos resultados en la preparación 1 es atribuido a que durante el proceso de obtención de este extracto se utilizaron molinos mecánicos, los cuales podrían alterar el estado de la proteína, ya que provocan una excesiva fricción de la planta contra las partes internas del equipo, lo cual lleva a que se eleve en demasía la temperatura durante el proceso (CUADRO 5).

Al realizar un resumen, se puede decir que los mejores resultados se obtuvieron con las preparaciones 2 y 3, y aunque en la preparación 2 se ven resultados más disminuidos, esto es debido a que la cantidad de materia prima vegetal utilizada es sólo de 4% p/v, lo cual es notoriamente menor a las utilizadas en las restantes preparaciones, en las cuales se usó al 10%. Otro motivo de encontrar en la preparación 2 resultados menores a los obtenidos en la preparación 3, es que en la preparación 2 se pierde una pequeña cantidad de materia prima en el homogenizador de pedestal.

Por otra parte, en la metodología de extracción propuesta por GUPTA y ESKIN (1977), se encontraron mejores resultados, en comparación a la metodología descrita por AÑON y MARTINEZ (1996), por el hecho que a pesar que los dos métodos son procedimientos para el aislamiento de proteínas en vegetales, el primero es un método destinado específicamente a la separación y purificación de enzimas vegetales que coagulen la leche.

De acuerdo a estos resultados se seleccionó el método de extracción indicado por GUPTA y ESKIN (1977), utilizando la preparación 3 (extracto de U.europaeus molido en forma manual), ya que con éste procedimiento se obtuvieron los mejores resultados, tanto para fuerza de cuajo, tiempo de coagulación y contenido de proteínas.



4.1.2.3. Determinación de la temperatura y pH óptimo de acción del extracto enzimático de origen vegetal. Una vez que se determinó que la extracción a utilizar sería la propuesta por GUPTA y ESKIN (1977), con la preparación 3, se realizaron análisis para determinar cuál será la temperatura y pH óptimo del cuajo, factores determinantes a la hora de buscar las condiciones óptimas para la elaboración de queso (ALAIS, 1985). Esto se realizó tomando como referencia el poder coagulante a diferentes rangos de temperaturas y pH.

Determinación de la temperatura óptima del cuajo extraído:

La FIGURA 7, indica que a 30°C se alcanza un máximo de fuerza con una relación de 1:2.010 g/mL (ANEXO 13), correspondiente a la temperatura óptima para el extracto enzimático vegetal extraído, la cual es similar a la señalada por CARRERA et al. (1999), ORTIZ DE APODACA et al. (1994) y VIEIRA DE SA y BARBOSA (1972), que trabajaron con enzimas vegetales extraídas de Cynara cardunculus (Cynarasa), planta que es comúnmente usada en la elaboración de quesos con cuajos vegetales, lo que se realizó a una temperatura de 30°C.

FIGURA 7. Temperatura óptima del extracto enzimático de origen vegetal

Además, así como MACEDO et al. (1993), indican que la temperatura de trabajo para las cynarasas es entre 27 y 29°C, otros autores, tales como VIOQUE et al. (2000) y NUÑEZ et al. (1991), señalan que debe ser de 29 y 28°C, respectivamente.

BURNETT (1976), menciona trabajos realizados con diferentes enzimas coagulantes de origen vegetal (Galium verum, Dipsacus sylvestris, Carlina corymbosa, etc) a una temperatura de 30°C. Por otra parte, GUPTA y ESKIN (1977), trabajaron con enzimas extraídas de la Benincasa cerifera (una especie de calabaza) y mencionan que la temperatura de coagulación debe ser de aproximadamente 35°C.

Determinación del pH óptimo del cuajo extraído:

La FIGURA 8 muestra que el pH óptimo encontrado para este extracto enzimático corresponde a 5,5, equivalente a una fuerza de cuajo de 1:2.010 g/mL (ANEXO 13). Este pH es similar al obtenido al final del proceso de extracción, por lo tanto no es necesario modificarlo para los restantes procedimientos.

FIGURA 8. pH óptimo del extracto enzimático de origen vegetal.

Además, este pH es similar al encontrado por VIEIRA DE SA y BARBOSA (1972), quienes trabajaron con Cynara cardunculus, a tres diferentes pH (6,6, 6,4 y 5,8), encontrando el óptimo a un pH igual a 5,8.

Posteriormente, CORDEIRO et al. (1992) y HEIMGARTNER et al. (1990), trabajando con otras enzimas vegetales señalaron que el pH de trabajo corresponde a 5,1.

En conclusión, según lo determinado, se utilizará la metodología de extracción propuesta por GUPTA y ESKIN (1977) con la preparación 3, a una temperatura de 30°C y un pH de 5,5.


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