Universidad austral de chile

səhifə	6/12
tarix	24.06.2016
ölçüsü	1.56 Mb.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 12

3.2. Enzimas coagulantes

Las enzimas coagulantes se extrajeron de la planta Ulex europaeus L. y se utilizó como enzima estándar el cuajo en polvo HALA, que se diluyó en agua destilada de acuerdo a los requerimientos de cada metodología.

3.3. Diseño experimental

A continuación, en el CUADRO 3, se presenta el diseño experimental propuesto para el desarrollo de este estudio.

CUADRO 3. Diseño experimental.

		Variables
Muestra	Factores	Planta	Extracto enzimático
Ulex europeo	Muestreos: A	- Humedad	-Contenido de proteína
(Niebla,	B	-Proteína total	-Fuerza de cuajo (actividad)
Valdivia)	C	-Toxicidad	-Tiempo de coagulación
			-Sinéresis del gel
			-Fuerza del gel
			-Electroforesis PAA-SDS
			-Cromatografía en DEAE celulosa

3.4. Análisis preliminares para determinar la mejor extracción de proteínas

Antes de comenzar con los análisis propiamente tales se realizaron ensayos preliminares, de manera de determinar la más eficiente extracción de proteínas.

Para este efecto se combinaron tres diferentes tipos de preparaciones de U. europaeus con dos metodologías de extracción distintas.

3.4.1. Preparaciones de la planta U. europaeus. A continuación se detallan los diferentes métodos de molienda de la planta U. europaeus para lograr la sucesiva extracción de proteínas.

3.4.1.1. Preparación 1: ramas enteras. Para esta preparación se buscó obtener como resultado un producto casi en polvo, gracias a la ayuda de molinos gruesos y finos. El procedimiento es el siguiente:

1. Las ramas enteras de la planta extraídas del suelo, se proceden a secar a temperatura ambiente durante 4 días, para de esta forma facilitar la molienda posterior.

2. Con ayuda de una tijera de podar pequeña se corta toda la planta extraída en tamaños más pequeños.

3. Mediante el uso de un molino grueso Split phase ac motor, modelo 4E, se muelen a una velocidad de 89 r.p.m.

4. Con un molino fino Retsch type 2M1, a velocidad 1 y con tamices de 4 y 1,5 mm. de diámetro interno, se llega a un producto en polvo.

3.4.1.2. Preparación 2: tallos y espinas. Con este proceso se obtiene un producto prepicado utilizando un homogenizador de pedestal. Su procedimiento se detalla a continuación:

1. Los tallos y espinas, se cortan manualmente con una tijera de podar pequeña y guantes de goma en tamaños más pequeños (0,5 a 1,0 cm.).

2. La planta se suspende al 4% p/v en agua destilada o Buffer acetato 0,01M (pH=5,5), dependiendo de la metodología a desarrollar, y luego se homogeniza con un Homogeneizador de pedestal por 60 seg.

3. Reposo por 12 horas en refrigeración.

3.4.1.3. Preparación 3: espinas y tallos finos. En esta preparación se obtiene un producto molido en forma manual. A continuación se señala su metodología:

1. Se cortan las espinas y tallos más finos con ayuda de una tijera de podar y guantes de goma.

2. Se muelen manualmente en mortero hasta la obtención de un producto final casi granulado (1 a 10 mm.).

3.4.2. Metodologías de extracción de proteínas. Se probaron 2 metodologías de extracción.

3.4.2.1. Extracción según AÑON y MARTINEZ (1996). Esta extracción señalada en la FIGURA 5, se realizó con la preparación 1 de U. europaeus L. y fue realizada en tres formas. La primera se llevó a cabo suspendiendo la planta reducida a polvo en agua destilada (a), tal y como indica la metodología original, la segunda se realizó con una modificación, que consiste en suspender la planta en buffer fosfato 0,08M (pH=6,5) en lugar de agua destilada (b), metodología probada con anterioridad por ORDOÑEZ (1995), y la tercera consistió en suspender en buffer acetato 0,01M pH 5,5 (c), como lo indica el procedimiento de extracción de enzimas vegetales realizado por GUPTA y ESKIN (1977).

FIGURA 5. Extracción de proteínas según AÑON y MARTINEZ (1996).

Posteriormente, se realizaron las extracciones a las preparaciones 2 y 3, en donde cabe señalar que para el caso de la preparación 2, se utilizó una suspensión al 4% debido al tamaño de la materia prima vegetal usada en la preparación.

3.4.2.2. Extracción según GUPTA y ESKIN (1977). La secuencia de esta extracción se muestra en la FIGURA 6 y se realizó con las preparaciones 1c, 2 y 3 de U. europaeus, donde las preparaciones 1c y 3 se suspendieron al 10% y la preparación 2 al 4% p/v.

FIGURA 6. Extracción de proteínas según GUPTA y ESKIN (1977).

3.4.3. Análisis de las preparaciones obtenidas. A cada una de las extracciones se le realizaron ensayos de contenido de proteínas, fuerza de cuajo y tiempo de coagulación, cuyos procedimientos serán señalados más adelante, a fin de determinar la extracción que entrega los mejores resultados.

Una vez realizado esto, se procedió a determinar la temperatura y pH óptimo para los extractos enzimáticos vegetales obtenidos de las diferentes extracciones. Esto se realizó probando el poder coagulante (fuerza de cuajo) a diferentes temperaturas (25, 30, 35, 40 y 45°C), mediante el uso de un baño María, donde se controlaba la temperatura de la leche antes de realizar el análisis. Además se probó el poder coagulante a diferentes pH del sustrato (4,5, 5,0, 5,5, 6,0 y 6,5), siendo ajustados estos distintos pH mediante la adición de NaOH 0,5 N y HCl 0,5 N.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 12