Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová

səhifə	7/10
tarix	24.06.2016
ölçüsü	2.28 Mb.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3.2Optimalizace real-time PCR a HRM

Vyšetření polymorfizmů bylo provedeno na vzorcích DNA izolované z leukocytů periferní krve na přístroji LightCycler 480 instrument™. Nejprve bylo nutné optimalizovat metodu HRM k detekci polymorfismu receptoru COX–1. Pro optimalizaci byly využity pozitivní kontroly. Mezi základní podmínky pro reprodukovatelnost této metody patří nízká koncentrace DNA (5–30 ng) a její čistota, C_t(počet cyklů, při kterých fluorescence dosáhne prahové hodnoty t) menší než 30 a správná laboratorní praxe.

3.2.1Teplota annealingu

Teplota pro hybridizaci primerů doporučená výrobcem je 60 °C. Pokud vzorek DNA neobsahuje aditiva a během reakce se nedochází ke tvorbě dimerů, teplota se nemění. Proto byla tato teplota při optimalizaci metody zvolena jako výchozí. Na obrázku (Obr. 12) lze pozorovat, že oblast před peakem je téměř uniformní. Takto bylo prokázáno, že během reakce nedochází ke tvorbě dimerů a reakční směs neobsahuje žádná aditiva. Z tohoto důvodu byla teplota pro hybridizaci primerů stanovena na hodnotu 60 °C.

Obr. 12. Sledování tvorby dimerů či přítomnosti aditiv v reakční směsi

3.2.2Návrh a koncentrace primerů

Primery byly navrženy pomocí programu Primer 3. Základní pilíře pro tvorbu primerů tvoří jejich specifita, sekundární struktury a tvorba dimerů. Dále je nutné, aby amplifikovaný úsek DNA obsahoval maximálně 100 párů bazí a teplota annealingu se pohybovala okolo 60 °C. Pro primery je nezbytné přečištění pomocí HPLC.

Koncentrace primerů v reakci byla detekována v rozmezí 0,1–0,3 μM. Jako ideální koncentrace pro stanovení polymorfismu destičkového receptoru COX–1 se ukázala koncentrace 0,2 μM, která je uprostřed rozmezí definovaného výrobcem.

3.2.3Titrace Mg²⁺

Koncentrace MgCl₂ pro každý pár primerů určuje specifickou amlifikaci DNA a je podstatným prvkem pro analýzu HRM. Proto byla provedena měření koncentrační řady MgCl₂ v rozmezí 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 a 3,5 mM. Tvorba specifických amplikonů probíhala nejlépe při koncentraci primerů 3,5 mM, jelikož nadbytek Mg²⁺ stabilizuje dvouřetězcovou DNA, čímž zabraňuje úplné denaturaci DNA a stabilizuje vazbu primerů na nesprávném místě.

3.2.4Nastavení Melting programu

Posledním krokem optimalizace HRM je vlastní nastavení programu tání DNA. Rozsah by měl být v oblasti 10–25 °C před T_m a 5 °C po T_m. Teplota tání se pohybovala blízko hodnoty 82 °C, jak lze vidět na obrázku (Obr. 13). Proto byl rozsah melting programu stanoven v rozmezí 70–87 °C.

Pomocí již popsaného postupu analýzy vzorku s využitím HRM se odlišili jen nemutovaní jedinci (wild type) a heterozygoti (Obr. 13). Heterozygotní forma, která tvoří heteroduplexy, má totiž strmější tvar křivky tání. Po derivaci této křivky lze jasně odlišit tento typ mutace tvorbou viditelného peaku.

Jelikož první měření prokázala nedostatečnou schopnost odlišení homozygotního typu mutace, bylo potřeba využít metodu spikování vzorků. Princip je založen na přidání určitého množství wild type DNA do všech vzorků. Tímto způsobem dojde k prokazatelnému odlišení homozygotů. Z diagnostických důvodů bylo potřeba, aby detekce pomocí HRM byla dostatečně robustní. Obvyklé množství wild type DNA pro spikování je 1/5 či 1/7. Pro přesnější odlišnost jednotlivých typů mutací, byla nakonec do všech vzorků přidávána wild type DNA v poměru 1:1. Měření probíhalo vždy dvakrát. V prvním případě bez přídavku wild type DNA, kdy bylo možné identifikovat heterozygoty. Druhé měření probíhalo již s přídavkem wild type DNA v poměru 1:1. Takto došlo k prokazatelnému odlišení homozygotů (Obr. 14). Vzorky DNA, které neprokázaly žádný typ mutace, byly nakonec stanoveny pomocí vylučovací metody.

Obr. 13. Graf křivky tání bez použití metody spikování vzorku

Obr. 14. Graf křivek tání s použitím metody spikování vzorků

3.3Vyšetření souboru pacientů

3.3.1Vyšetření aspirinové rezistence funkčním testem

Bylo vyšetřeno 90 pacientů s akutním infarktem myokardu. Hranice cut–off určující účinnost protidestičkové léčby byla stanovena na hodnotu 200 AUC (Ulehlová et al., 2011). Pacienti, kteří mají nižší hodnotu agregace, odpovídají na léčbu. Zatímco u pacientů, jejichž hodnota agregace je vyšší, lze předpokládat neúčinnost protidestičkové léčby. Léčba je účinná u 65,5 % pacientů (Tab. 8, Obr. 15). U dalších 34,4 % pacientů lze předpokládat rezistenci na léčbu ASA nebo špatnou utilizaci účinné látky. Funkční test na měření agregační schopnosti destiček by tak mohl sloužit k identifikaci pacientů, kteří na léčbu nereagují.
Tab. 8. Účinnost léčby pomocí ASA

Účinnost aspirinové léčby	Počet pacientů	% účinnost
+	59	65,6
–	31	34,4

Obr. 15. Zobrazení účinnosti protidestičkové léčby

3.3.2Genotypizace

Bylo vyšetřeno 90 pacientů s akutním infarktem myokardu, kde stanovením reziduální agregace byla zjištěna 34,4% neúčinnost aspirinové léčby. Jeden z hlavních faktorů, který ovlivňuje selhání protidestičkové léčby, je genetická predispozice v polymorfismech destičkových receptorů. Z důvodu medikace ASA byl vybrán destičkový receptor COX–1. Zastoupení polymorfismu destičkového receptoru COX–1 ve vyšetřovaném souboru je zobrazeno v Tab. 9.
Tab. 9. Zastoupení polymorfismu destičkového receptoru COX–1

Polymorfismus	Typ mutace	Celý soubor		Rezistentní
Polymorfismus	Typ mutace	Počet	%	Počet	%
COX-1	heterozygot	7	6,3	5	12,2
	homozygot	1	0,9	0	0
	wild type	82	73,8	36	87,8

Výskyt polymorfismu destičkového receptoru COX–1 byl ve skupině 90 pacientů stanoven na 6,3 % pro heterozygotní formu a 0,9 % pro homozygotní formu (Obr. 16). Frekvence výskytu polymorfismu receptoru COX–1 byly dále porovnávány vzhledem k pohlaví a věku jednotlivých pacientů (Obr. 17; Obr. 18). Ve sledovaném souboru pacientů (63 mužů a 27 žen) byl zjištěn vyšší výskyt polymorfismu receptoru COX–1 u mužů. Zhledem k věku vyšetřovaných pacientů lze vidět nárůst výskytu polymorfismu ve věku nad 60 let. Je však důležité věnovat pozornost i mladé skupině pacientů (20–30 let), kdy narůstá frekvence výskytu polymorfismu destičkového receptoru COX–1.

Obr. 16. Procentuální zastoupení polymorfismu receptoru COX–1

Obr. 17. Zastoupení polymorfismu receptoru COX–1 v závislosti na pohlaví

Obr. 18. Výskyt polymorfismu receptoru COX–1 podmíněný věkem vyšetřovaných pacientů

Statistická analýza byla provedena s využitím software SPSS verze 15 (SPSS Inc., Chicago, USA). Závislost mezi odpovědí na léčbu a mutačním stavem receptoru COX–1 byla zhodnocena prostřednictvím Mann-Whitney U testu, který prokázal signifikantně vyšší agregaci krevních destiček u mutačního stavu homozygot nebo heterozygot (medián 442) ve srovnání s mutačním stavem WT (medián 111), p = 0,040 (Obr. 19).

Obr. 19. Porovnání závislosti mezi odpovědí na protidestičkovou léčbu a mutačním stavem receptoru COX–1

Box graf popisuje distribuci hodnot měřeného parametru pomocí kvartilů. Silná čára uvnitř boxu reprezentuje medián hodnot (tj. 2. kvartil), dno boxu reprezentuje 1. kvartil a víko boxu 3. kvartil. Výška boxu odpovídá mezikvartilovému rozpětí (tj. charakteristice variability dat – v intervalu mezi 1. a 3. kvartilem leží 50% naměřených hodnot). Anténka dole a nahoře odpovídají minimální a maximální neodlehlé hodnotě. Odlehlé hodnoty jsou označeny symbolem kroužek a extrémní hodnoty symbolem hvězdička.
Tab. 10. Přehled výsledků genotypizace a impedanční agregometrie

Pohlaví	Rok narození	COX-1	MEA (AUC)
muž	1965	heterozygot	159
muž	1967	heterozygot	274
muž	1965	heterozygot	610
žena	1984	heterozygot	837
muž	1931	heterozygot	854
muž	1949	heterozygot	151
muž	1939	heterozygot	832
muž	1966	homozygot	34
muž	1970	WT	11
muž	1963	WT	13
muž	1975	WT	14
muž	1968	WT	19
muž	1966	WT	27
muž	1976	WT	30
muž	1965	WT	30
žena	1962	WT	33
muž	1955	WT	37
muž	1966	WT	39
muž	1974	WT	50
muž	1967	WT	50
muž	1970	WT	51
muž	1978	WT	57
muž	1966	WT	58
žena	1976	WT	59
muž	1965	WT	60
muž	1966	WT	62
muž	1941	WT	66
žena	1964	WT	74
muž	1967	WT	81
muž	1969	WT	90
muž	1968	WT	90
žena	1975	WT	91
muž	1971	WT	93
muž	1949	WT	93
žena	1951	WT	94
muž	1947	WT	95
žena	1960	WT	96
žena	1975	WT	97
žena	1973	WT	98
muž	1969	WT	101
muž	1943	WT	107
žena	1936	WT	109
žena	1978	WT	111
muž	1950	WT	111
muž	1969	WT	111
žena	1968	WT	115
žena	1936	WT	127
muž	1950	WT	133
muž	1970	WT	137
muž	1971	WT	139
muž	1945	WT	139
muž	1933	WT	150
muž	1962	WT	152
žena	1937	WT	162
muž	1955	WT	164
muž	1971	WT	168
žena	1930	WT	174
muž	1967	WT	199
žena	1971	WT	207
muž	1951	WT	222
muž	1932	WT	231
muž	1955	WT	297
žena	1926	WT	297
žena	1956	WT	300
žena	1971	WT	333
muž	1923	WT	456
žena	1978	WT	468
muž	1934	WT	486
muž	1939	WT	512
žena	1958	WT	512
muž	1934	WT	523
muž	1934	WT	537
muž	1940	WT	571
muž	1961	WT	631
muž	1937	WT	648
muž	1975	WT	652
muž	1953	WT	749
muž	1959	WT	751
žena	1951	WT	783
muž	1956	WT	825
muž	1968	WT	980
žena	1939	WT	1101
muž	1967	WT	1102
žena	1952	WT	1106
muž	1929	WT	115
žena	1956	WT	80
žena	1992	WT	93
muž	1946	WT	57
muž	1968	WT	39
žena	1941	WT	76