Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová

1.2Složka tkáňová

1.3Krevní destičky

Hlavní úloha krevních destiček je zastavit krvácení při poškození cévní stěny. Spočívá v jejich adhezi na odkrytý subendotel a následnou agregací, kterou doprovází sekrece cytoplazmatického obsahu a biologicky aktivních látek. Tím se vytvoří hemostatická zátka, která zabraňuje dalšímu krvácení poškozené cévy (Corash & Shafer, 1981).

Rozlišujeme tři základní typy hemostatických zátek:

• 
  Bílý trombus – obsahuje malé množství červených krvinek a je tvořen především krevními destičkami a fibrinem. Tvoří se při poškození cévní stěny nebo jejich abnormalitách v tepnách, kde je velmi rychlý tok krve.
  
• 
  Červený trombus – je tvořen z červených krvinek a fibrinu. Vzniká nejen při poškození cévní stěny, ale i v nepoškozeném místě v místech zpomaleného toku krve.
  
• 
  Roztroušený fibrinový deposit – vzniká v kapilárách nebo malých cévách (Murray & Harfenist, 2002).
  

1.3.1Základní patofyziologie krevních destiček

Normální množství destiček se pohybuje mezi 130–430*10⁹ v 1 litru krve, jejich objem (MPV) se pohybuje v rozmezí 7–12 fl. (Sottile et al., 1989). Z tohoto množství se asi dvě třetiny destiček nachází v krevním řečišti a jedna třetina je uložena ve slezině jako rezerva uvolněná při větších ztrátách krve. Životnost destiček je 7–10 dnů, ale může se měnit při různých patologických stavech. Vlastnosti a velikost je závislá na jejich stáří. Mladší destičky jsou větší a obsahují větší počet granul se serotoninem a větší počet vazebných míst pro léčiva na membráně, zatímco starší destičky jsou menší a mají menší obsah serotoninu (Matýšková et al., 1999; Nosáľ & Jančinová, 1990).

Mezi nejdůležitější organely destiček patří: plasmatická membrána, granuly, cytoskleleton, otevřený kanikulární systém a denzní tubulární systém (David-Ferreira, 1964). Anatomicky a funkčně se krevní destičky dělí na čtyři oblasti:

• 
  periferní zóna,
  
• 
  sol–gel zóna,
  
• 
  organelová zóna,
  
• 
  membránová zóna.
  

1.3.1.1Periferní zóna

Glykokalyx je 10–50 nm hrubý obal, který zasahuje do výstelky otevřeného kanikulárního systému. Je složen především z glykoproteinů, které slouží jako receptory (např. pro trombin, ADP či kolagen). Můžeme je rozdělit do 7 hlavních skupin, jež se označují římskými číslicemi I–VII. Signály spouštějící agregaci přenášejí glykoproteiny Ib, IIb, IIIa. Příčinou některých nemocí (Bernard-Souliérův syndrom) je někdy nepřítomnost nebo chyba ve složení některých membránových glykoproteinů (Leung & Nachman, 1986; Nosáľ & Jančinová, 1990).

Destičková membrána se skládá z lipidové dvojvrstvy, kterou někdy nazýváme jako destičkový faktor 3 (PF3). PF3 se podílí na krevním srážení. Na povrchu krevních desiček se nachází sfingomyelin a fosfotidylcholin. Fosfatidyletanolamin, fosfatidyl serin a fosfatidylinositol jsou na vnitřní straně membrány. Fosfatidylcholin a fosfatidylinositol jsou zdroje kyseliny arachidonové. Transfer Ca²⁺ v membráně je umožněn díky fosforylaci fosfatidylinositolu. Hlavní složkou plazmastické membrány je cholesterol, který zajišťuje pružnost membrán, ovlivňuje transport a propustnost membrán (Matýšková et al., 1999). Fosfolipidy a cholesterol vytváří biofyzikální bariéru. Tekutost membrány závisí na věku destičky a fyzikálně-chemických podmínkách okolí, jako je pH, teplota, přítomnost organických látek a léčiv. Lipidová membrána obsahuje řadu integrálních či periferních proteinů, které představují enzymatický aparát membrány (Nosáľ & Jančinová, 1990).

Součástí submembránové oblasti jsou krátká aktinová vlákna spojená s plasmatickou membránou, která se podílí na tvorbě pseudopodií při aktivaci destičky (Matýšková et al., 1999).

1.3.1.2Sol–gel zóna

1.3.1.3Organelová zóna

Obr. 1. Schematické znázornění struktury krevní destičky

(přepracováno podle: Bentfeld-Barker & Bainton, 1982)

1.3.1.4Membránová zóna

V cévní stěně probíhá metabolismus kyseliny arachidonové, která je přítomna v krevní plazmě a ve fosfolipidech stěny buněk všech tkání. K její metabolizaci dochází pomocí enzymů cyklooxygenasy a lipooxygenasy. Pokud je metabolizován cestou cyklooxygenasy, vznikají prostaglandiny (PGG₂, PGH₂, PGE₂, PGD₂), prostacyklin (PGI₂) a tromboxan A₂ (TXA₂). Vznik TXA₂ je silným stimulačním impulsem agregace a uvolňovací reakce. Při blokování cyklooxygenasy můžeme výrazně ovlivnit funkci krevních destiček (Matýšková et al., 1999).

1.3.2Vznik krevních destiček

Pučení krevních destiček na povrchu megakaryocytu bylo sledováno pomocí elektronového mikroskopu. Byl popsán model tvorby destiček na základě jejich uvolňování z cytoplasmy megakaryocytu (Djaldetti et al., 1979; Ihzumi et al., 1977).

Druhý model představuje fragmentaci cytoplasmy pomocí DMS (vymezení membránového systému) na jednotlivá „destičkové teritoria“ (Yamada, 1957). S použitím mikroskopie lze pozorovat, že zrající megakaryocyty jsou postupně plněny membránami a specifickými organelami. Právě tyto membrány později vytvoří teritoria nově vznikajících destiček. Tento model předpokládá rozsáhlý reorganizační proces vnitřních membrán, kdy se jednotlivé fragmenty cytoplasmy organizují podél DMS (Shaklai & Tavassoli, 1978; Kosaki, 2005).

Třetí průtokový model vyžaduje formaci prodestičky, která vytváří dlouhé výběžky cytoplasmy jako pseudopodia, která se následně z megakaryocytu odštěpují. DMS má funkci zásobárny membrán pro nově vytvořené destičky (Wright, 1906; Patel et al., 2005).

1.3.3Funkce krevních destiček

Stupeň aktivace krevních destiček je regulován dynamicky mnoha inhibitory a aktivátory tak, aby se současně udržela rovnováha mezi koagulačním a fibrinolytickým systémem (Kubisz et al., 1987; Pecka, 2004; Trávníčková, 2003).

1.3.3.1Primární hemostasa

Proces agregace trvá přibližně 8–20 s. Současně probíhá i odkrytí povrchových fibrinogenových receptorů na povrchu destičkových membrán. Pomocí mezidestičkového kontaktu se aktivují další destičky, které uvolní ze svých granul ADP. Při nízké koncentraci ADP mění destičky svůj tvar. Při vysokých koncentracích (2–5 μM) ADP, adrenalinu, kolagenu i trombinu nastává uvolňovací reakce a ireversibilní agregace. Pro reakci je nezbytná přítomnost vápenatých iontů (Huang & Detwiler, 1980; Nosáľ & Jančinová, 1990; Shattil & Bennett, 1981).

ADP je zodpovědný za počátek primární agregace. Uvolňuje se z porušených buněk a tkání. Snižuje hladinu cAMP destiček, která způsobí mobilizaci vápenatých iontů. Následuje aktivace fosfolipasy A₂, která se podílí na odštěpení kyseliny arachidonové z membránových fosfolipidů. Arachidonová kyselina se rychle metabolizuje na TXA₂. Reverzibilní agregace je spojena s vazbou fibrinogenu na aktivované receptory GP IIb a IIIa, které se nachází volně v cytoplazmatické membráně. Po uvolnění vápníku se oba receptory spojí a takto jsou schopné vázat fibrinogen, který vytvoří mezidestičkové mosty. Jedna destička obsahuje až 40 000 vazebných míst pro fibrinogen.

Při ireverzibilní agregaci je podstatné uvolnění obsahu α-granul, trombospondinu a fibronektinu, který zpevňuje mezidestičkové spojení a vazbu fibrinogenu. Trombospondin je stabilizujícím prvkem, který je syntetizován a vylučován fibroblasty, buňkami endotelu a hladkých svalů.

Agregace je zakončena retrakcí (smrštěním vytvořené krevní zátky). Tento proces je analogií kontrakce svalu. Způsobuje lepší uzavření rány. Retrakci podporuje vazba fibrinogenu na komplex GP IIb/IIIa (Matýšková et al., 1999; Nosáľ & Jančinová, 1990).

1.3.3.2Plazmatický koagulační systém

Místem syntézy koagulačních činitelů jsou játra. Některé faktory (II, VII, IX, X a XIV) jsou závislé na přítomnosti vitamínu K, který slouží při karboxylaci γ-karboxyglutámového zbytku. Bez této reakce by se nemohly navázat vápenaté ionty. Většina z koagulačních faktorů je obsažena v plazmě v nízkých koncentracích kromě faktoru I a II (fibrinogen, protrombin). V plazmě se vyskytují ve formě proenzymu a jsou štěpeny předcházejícím enzymem na aktivní formu. Mezinárodní komise označuje jednotlivé koagulační faktory římskými číslicemi dle časové posloupnosti jejich objevení. Aktivní forma enzymu se značí malým písmenem a, např. F IIa (Matýšková et al., 1999; Pecka, 2004; Trávníčková, 2003).

Koagulační faktory jsou z velké části glykoproteiny, které svým charakterem odpovídají proenzymům a kofaktorům. Některé z nich mají po rozštěpení enzymatickou aktivitu (F II, VII, IX, X, XI, XII, prekalikrein). V jejich aktivním místě se nalézá serin, a proto se řadí mezi serinové proteasy. Narozdíl od nich se faktory VIII, V a vysokomolekulární kininogen HMWK po svém rozštěpení podílejí na tvorbě koagulačně aktivních komplexů. Jedná se o kofaktory (Pecka, 2004).

Mezi základní koagulační faktory řadíme:

• 
  Faktor I (fibrinogen) je rozpustný protein. Skládá se ze tří párů polypeptidových řetězců α, β a γ. Pro udržení stability a struktury fibrinogenu je důležitá přítomnost vápenatých iontů.
  
• 
  Faktor II (protrombin) je poměrně stabilní globulin. Klíčovou roli hraje při štěpení fibrinogenu na fibrin a aktivaci kofaktorů FV a FVIII. Při dostatku trombinu tyto faktory degraduje. Kromě toho aktivuje FXIII a FIX.
  
• 
  Faktor III (tkáňový tromboplastin) je transmembránový apoprotein.Spojením s membránovým fosfolipidem se stává aktivním. Nalézá se na buňkách stýkajících se s krví získanou z protržené cévy.
  
• 
  Faktor IV (vápenaté ionty) patří mezi nezastupitelné složky pro většinu dějů koagulační kaskády.
  
• 
  Faktor V (proakcelerin) slouží jako kofaktor komplexu, jenž aktivuje protrombin. Nachází se v plazmě a granulích krevních destiček a vzniká v játrech a megaryocytech.
  
• 
  Faktor VII (prokonvertin) je aktivátor protrombinu s krátkým biologickým rozpadem. Jeho působením se aktivuje faktor X.
  
• 
  Faktor VIII (antihemofilický faktor) se váže na povrch aktivovaných destiček a umožňuje jejich adhezi na kolagen. V plazmě koluje navázán na von Willebrandův faktor. Jeho nepřítomnost způsobuje poruchu koagulace známou jako hemofilie A.
  
• 
  Faktor IX (Christmasův faktor) je proenzym, který v aktivní formě přeměňuje faktor X na Xa. Je to možné až po aktivaci faktorů VIIIa, X a při výskytu vápenatých iontů.
  
• 
  Faktor X (Stuartův-Prowerův faktor) je podstatný činitel při aktivaci protrombinu.
  
• 
  Faktor XI (Plasma Tromboplastin Antecedent) patří mezi proenzymy kontaktního systému. Vykytuje se v játrech.
  
• 
  Faktor XII (Hagemanův faktor) je aktivován při poranění díky kontaktu se subendotelovými strukturami nebo proteasami. Proto je prvním krokem aktivace vnitřního systému hemokoagulace.
  
• 
  Faktor XIII (fibrin stabilizující faktor) je posledním faktorem koagulace. Přispívá k produkci fibrinové sítě vytvářením kovalentních vazeb.
  
• 
  Prekalikrein je globulin tvořený játry. Jako enzym aktivuje faktory XII a XI.
  
• 
  HMWK (kinogen o vysoké molekulové hmotnosti) je plazmatický protein, který působí jako kofaktor na začátku vnitřního systému koagulace.
  
• 
  Faktor XIV (protein C) je proenzym antikoagulační serin-proteasy. Protein S slouží jako jeho kofaktor (Matýšková et al., 1999; Trávníčková, 2003).
  

Obr. 2. Plazmatický koagulační systém

(přepracováno podle: Trávníčková, 2003)
Vnější systém

Při poškození tkáně cévní stěny (bariéra oddělující buňky nesoucí tkáňový faktor od cirkulující krve) vzniká v místě poškození koagulačně aktivní komplex tkáňového faktoru s VIIa, který v malém množství volně cirkuluje v plazmě. Tento krok je klíčový pro iniciaci hemostasy. Pro jeho funkci je nezbytná přítomnost vápenatých iontů. Komplex aktivuje F Xa, který společně s F Va vytvoří komplex protrombinasy. Dalším krokem je přeměna protrombinu na trombin. Trombin iniciuje vznik fibrinu z fibrinogenu a aktivuje F XIII. Jednotlivá vlákna fibrinu polymerizují a jsou stabilizovány F XIIIa (Nemerson, 1988; Pecka, 2004; Weiss et al., 1989).

Začátek kaskády dějů ve vnitřním systému znázorňuje kontakt s negativně nabitým povrchem (obnažená místa při poranění). Fáze kontaktu zahrnuje interakci mezi tímto povrchem (kolagen, bazální membrána) a Hagemanovým faktorem. F XIIa následně aktivuje faktory XI a IX. Postupně je signál zesílen, což způsobuje aktivaci faktorů V a VIII. Vzniká tenasa faktorů IXa a VIIIa, která produkuje dostačující množství F Xa. Ten společně s F Va, fosfolipidy membrány krevní destičky a vápenatými ionty vytváří komplex protrombinasy, který štěpí protrombin na trombin v místě vazby argininu. Klíčovým bodem této reakce je přesná prostorová orientace všech zúčastněných komponent. F Xa je sám schopen vyvolat reakci přeměny protrombinu na trombin, ale vazbou na komplex protrombinasy se tento proces urychlí až 200 000krát. Následující reakce jsou již identické s ději probíhajícími ve vnějším systému (Heimark et al., 1980; Hemker et al., 1967; Pecka, 2004).

1.3.4Účast krevních destiček v patofyziologii onemocnění

• 
  Primární poruchy – jsou často provázené krvácivými stavy. Jedná se především o strukturální poruchy destiček či nepřítomnost některých membránových receptorů, enzymových komplexů nebo granul.
  
• 
  Sekundární poruchy – zastupují především kardiovaskulární nemoci (ischemická srdeční choroba, infarkt myokardu, mozkové příhody, arteriální a venosní trombosy) a metabolické poruchy (aterosklerosa a diabetes mellitus) (Nosáľ & Jančinová, 1990).
  

Jakmile je porušena rovnováha mezi aktivátory a inhibitory hemokoagulace, dochází k hypokoagulabilitě (krvácení) či hyperkoagulabilitě (trombosa). Při hyperkoagulabilitě se tvoří krevní sraženiny, které neslouží k zástavě krvácení, ale zabraňují průtoku krve postiženou cévou. Vznik trombosy je závislý na Virchowově triádě, kterou tvoří cévní stěna, složky krve a prodění krve (Bruhn et al., 2003).

• 
  Věk – Vývoj aterosklerosy začíná už v dětství, ale samotné onemocnění se projevuje až v dospělosti, a to u mužů dříve než u žen.
  
• 
  Pohlaví – Výskyt onemocnění je vyšší u mužů. Tento rozdíl lze pozorovat ve středním věku, kdy je úmrtnost na ischemickou chorobu srdce 5krát nižší u žen než u mužů. Ženské pohlavní hormony estrogeny totiž působí protektivně, avšak po menopauze se riziko nemoci zvyšuje.
  
• 
  Rodinná dispozice – Jedná se o geneticky podmíněnou poruchu metabolismu lipoproteinů a vysokou hladinou krevních lipidů.
  

• 
  Hyperlipidémie – Riziková hladina cholesterolu pro vznik aterosklerosy je 6,2 mmol/l a vysoce riziková hladina dosahuje až 7,7 mmol/l. Hypercholesterolémie je spojena s vysokou hladinou lipoproteinů s nízkou denzitou (LDL a VLDL) a nízkými hladinami lipoproteinů s vysokou denzitou (HDL). HDL odstraňuje cholesterol z intimy. Hlavní podíl na vysoké hladině cholesterolu mají genetické vlivy a dietní režim (velká spotřeba živočišných tuků, vajec, jednoduchých cukrů spojená s malým příjmem vysokomolekulárních cukrů a vláknin).
  
• 
  Hypertenze – U hypertoniků (tlak vyšší než 160/95) je výskyt ischemické choroby srdce častější než u normotoniků.
  
• 
  Kouření cigaret – Mezi hlavní aterogenní faktory kouření patří nikotin a oxid uhelnatý, které poškozují endotel cévní stěny. Kouření ovlivňuje vznik onemocnění u dospívajících a mladých lidí.
  
• 
  Diabetes mellitus – Nebezpečí infarktu myokardu je u diabetiků 2–3krát vyšší než u nediabetiků. Mezi rizikové faktory je řazen proto, že vede k hypercholesterolémii (Nosáľ & Jančinová, 1990; Povýšilová & Šteiner, 2007).
  

1.3.4.1Podíl krevních destiček na vzniku a rozvoji aterosklerosy a kardiovaskulárních onemocnění

• 
  Fibrózní plát, který je tvořen kolagenním vazivem. Obsahuje nepatrné množství lipidů, a proto má světle šedou barvu a tuhou konzistenci.
  
• 
  Ateromový plát obsahuje vyšší počet lipidů jako cholesterol a jeho estery. Jeho barva je nažloutlá a má měkčí konzistenci. Mezi komplikace ateromového plátu patří zvředovatění, trombosa, krvácení a kalcifikace.
  

1.3.4.2Manifestace kardiovaskulárních změn ve formě akutního infarktu myokardu u rizikových pacientů

Při akutních srdečních příhodách byly stanoveny patologie krevních destiček, jako je snížený počet krevních destiček cirkulujících v periferní krvi nebo zvětšení jejich středního objemu, což zjevně souvisí s jejich namáháním při zúžení arterií. Jejich zúžení společně s přítomností destičkových agregátů vzniklých při aktivaci na poškozeném endotelu pak způsobuje ischemii myokardu. Uvolnění shluků agregovaných destiček může způsobit distální embolizaci malých arteriol, která vede infarktu myokardu. Velký význam je kladen na porušení rovnováhy mezi zvýšenou tvorbou TXA₂ a na druhé straně sníženou produkcí PGI₂, který má vazodilatační účinek a patří k inhibitorům destičkových funkcí (Aherne et al., 1986; Butkus et al., 1982; Nosáľ & Jančinová, 1990).

Mezi nejsilnější aktivátory cirkulujících krevních destiček patří:

• 
  lipidové části plátu,
  
• 
  kolagen,
  
• 
  trombin,
  
• 
  cirkulující katecholaminy,
  
• 
  ADP uvolňovaný z krevních destiček a hemolyzovaných červených krvinek,
  
• 
  serotonin a TXA₂ podporující agregaci a vazokonstrikci.
  

Akutní infarkt myokardu je stále předmětem zkoumání, a proto vzrůstá počet informací o příčinách a mechanismech tohoto onemocnění u pacientů v mladém věku (muži 18–45 let, ženy 18–55 let).

1.3.4.3Farmakologické ovlivnění funkcí krevních destiček

• 
  adheze a agregace destiček v místě poranění (primární hemostasa),
  
• 
  aktivace koagulace (sekundární hemostasa),
  
• 
  fibrinolysa zajišťující obnovení průtoku krve postiženou oblastí (rozpuštění fibrinu v trombech).
  

• 
  Antikoagulancia – ovlivňují tvorbu a působení koagulačních faktorů a snižují srážlivost krve.
  
• 
  Protidestičkové léky – slouží k zamezení vzniku hemostatické zátky, neboť inhibují některé funkce krevních destiček.
  
• 
  Trombolytika – rozpouštějí vytvořené hemostatické zátky a stimulují rozprostření fibrinové sítě (Hynie, 2001; Pecka, 2004).
  

Antiagregační léčba se využívá při léčbě pacientů s kardiovaskulárními poruchami. Jelikož je úmrtnost na kardiovaskulární choroby jednou z nejvyšších na světě, zaměřila jsem se ve své práci na jejich prevenci a léčbu.

1.3.4.4Protidestičkové léky

Antiagregační léčba omezuje shlukování krevních destiček. Agregaci můžeme regulovat pomocí dvou protikladných faktorů. TXA₂ zvyšuje agregaci a podporuje vazokonstrikci, zatímco PGI₂ inhibuje agregaci krevních destiček a vyvolává vazodilataci. Z mechanismu účinku PGI₂ a TXA₂ je zřejmé, že mezi těmito látkami existuje funkční antagonismus při ovlivňování cévního průsvitu a agregace destiček. Obě látky vznikají z kyseliny arachidonové.

Kyselina arachidonová je reaktivní nenasycená mastná kyselina. Ve své struktuře obsahuje dvacet uhlíkových atomů se čtyřmi dvojnými vazbami. V nepatrném množství se vyskytuje jako složka polárních lipidů, které jsou základem struktury biologických membrán. Z této vazby se může uvolnit účinkem fosfolipasy A₂. Působením enzymů se přeměňuje na mimořádně účinné lokální hormony eikosanoidy (Obr. 3). Eikosanoidy tvoří čtyři rozdílné skupiny: prostaglandiny, prostacyklin, tromboxany a leukotrieny. Prostaglandiny, prostacyklin a tromboxany se tvoří z cyklických endoperoxidů. Jedná se o cyklizované mastné kyseliny (deriváty kyseliny prostanové), které se označují jako prostanoidy.

PGI₂ vzniká v cévním endotelu z cyklických endoperoxidů působením prostacyklinsyntasy. Jeho poločas je pět minut. PGI₂ je významný pro fyziologickou regulaci periferního prokrvení. TXA₂ vzniká především v krevních destičkách. Jeho poločas je 30 sekund. Působí ke zvýšení agregace destiček, čímž se podílí na tvorbě uzávěru při poškození cévní stěny.

Mezi inhibitory agregace krevních destiček patří kyselina acetylsalicylová (ASA), thienopyridiny (ticlopidin, clopidogrel) a inhibitory IIb/IIIa receptoru (abciximab, tirofiban a eptifibatid). Nejpoužívanějším léčivem je ASA (Lüllmann et al., 2009; Pecka, 2004).

Obr. 3. Regulace metabolismu kyseliny arachidonové a účinky eikosanoidů

(přepracováno podle: Lüllmann et al., 2009)

1.3.4.5Kyselina acetylsalicylová

ASA, původně izolovaná z vrby (salix alba), je látka, která má antipyretické, analgetické, protizánětlivé a antiagregační účinky (Obr. 4). V krevních destičkách a buňkách endotelu ireverzibilně inhibuje cyklooxygenasu (COX–1) tím, že ji acetyluje. V buňkách endotelu je schopnost tvořit prostacyklin porušena přechodně, neboť cyklooxygenasa se opět rychle vytvoří. Naproti tomu krevní destičky nejsou způsobilé enzymy znovu vytvářet, protože jsou to jen bezjaderné buněčné fragmenty. Tvorba TXA₂ je tedy pozastavena na 7–11 dní, což odpovídá životnosti destičky. Aby byla agregace destiček utlumena, je potřeba podávat ASA takovým způsobem, který umožňuje obnovení syntézy PGI₂.

Obr. 4. Vzorec kyseliny acetylsalicylové

(přepracováno podle: http://www.chemspider.com)
ASA musí do destiček vstoupit nezměněna, abychom zabránili tvorbě nežádoucí eikosanoidů acetylací enzymu. Krevní destičky jsou mobilní, zatímco endotel je fixován na místě. Při perorálním podání ASA dochází v játrech k její deacytylaci. Destičky jsou takto vystaveny její vyšší koncentraci narozdíl od endotelu. Při vhodném dávkování bude tedy převažovat inhibice TXA₂.

ASA se podává v odstupu více dní (300 mg každý druhý den) nebo denně (50–100 mg). Tím dosáhneme zamezení vzniku nežádoucích hemostatických zátek v artériích. Při dlouhodobém podávání vyšších dávek ASA (160 mg) se vyskytuje řada nežádoucích účinků. Mezi další nežádoucí účinky patří závratě, poruchy sluchu, bolesti hlavy, poškození žaludeční sliznice, zhoršení renálních funkcí a především vyvolává krvácení. Terapie pomocí ASA se využívá u nemocí, jako jsou angina pectoris, sekundární profylaxe (předcházení pravděpodobných následků), po infarktu myokardu nebo u mozkového infarktu (Hynie, 2001; Lüllmann et al., 2009; Roth et al., 1975).

1.3.4.6Rezistence na ASA

Laboratorně představuje rezistence na ASA selhání prokazatelné inhibice destičkových funkcí in vitro při medikaci ASA. Nevýhodou laboratorního stanovení je možnost užití více metod působení ASA, jejich různá citlivost i specifita. Pokud je léčba ASA neúčinná, dochází stále ke tvorbě TXA₂, jehož metabolit lze detekovat v moči nebo v séru. Další testy sledují nedostačující inhibici agregační schopnosti krevních destiček i při užívání ASA. Stimuly k aktivaci a agregaci destiček mohou přicházet i jinou cestou než skrze TXA. Použité metody se u jednotlivých studií liší, a proto je obtížné je vzájemně porovnávat. Testy, které se zaměřují na potlačení funkce destičky, jsou přínosnější než stanovení jednotlivých metabolitů (Hilmerová & Filipovský, 2004; Karetová & Bultas, 2005).

1.3.4.7Detekce polymorfismu destičkových receptorů jako možné příčiny rezistence na ASA

Geneticky podmíněné příčiny selhání protidestičkové léčby se dělí na změny v cytochromu P–450, kde dochází k utilizaci ASA, a změny destičkových receptorů. Jelikož utilizace ASA v cytochromu P–450 je podrobně prozkoumána, my jsme se v naší práci zaměřili na změny destičkových receptorů, kde situace není dosud plně objasněna. Mezi geneticky podmíněné změny destičkových receptorů, které způsobují rezistenci na ASA, patří polymorfismus destičkového receptoru COX–1.

Mnoho studií hledalo spojitost mezi aspirinovou rezistencí a polymorfismy v genu pro COX–1 (Goodman et al., 2007). Známe 31 studií studií, které identifikovaly celkem 50 polymorfismů v 11 genech. Jednotlivé typy polymorfismu pro COX–1 jsou zobrazeny v Tab. 1 (Goodman et al., 2008). Mnoho z těchto polymorfismů nebylo dále klinicky ověřováno. Proto jsme vybrali polymorfismus pro cykloxygenasu –842A > G.
Tab. 1. Jednotlivé typy polymorfismů, které souvisí s aspirinovou rezistencí

Se zřetelem na poslední vývoj v této oblasti (Kvasnička et al., 2009; Maree et al., 2005) jsme s ohledem na požadované využití v rutinní diagnostice, která požaduje rychlé a efektivní zpracování vzorků, zvolili real–time PCR (PCR v reálném čase, RT PCR) v podobě HRM (vysokorozlišovací analýza křivek tání). Tuto metodu jsme využili k identifikaci bodové mutace destičkového receptoru COX–1 (–842A > G).

Metoda RT PCR je moderní molekulárně genetická technika umožňující rychlou, citlivou a spolehlivou detekci včetně kvantifikace specifického úseku DNA nebo RNA. Amplifikace řetězce DNA probíhá pomocí metody PCR. Základem PCR reakce je opětovná replikace úseku DNA pomocí termostabilní DNA polymerasy (zpravidla Taq polymerasy izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus) v procesu teplotního cyklování. Daný úsek DNA je ohraničen specifickými primery. Množství amplifikované DNA narůstá exponenciálně. RT PCR sleduje vývoj PCR přímo během reakce (tzv. „v reálném čase“) pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Interkalační barviva mají tu výhodu, že umožňují použít PCR produkt pro další zpracování, např. pro HRM.

HRM je metoda, která následuje po ukončení PCR reakce, a slouží ke zjištění povahy produktů PCR. Tání DNA představuje proces separace DNA na jednotlivá vlákna, které je vyvoláno postupným zvyšováním teploty.

Tání DNA lze sledovat tak, že roztok dvouvláknové DNA ochladíme po skončení PCR reakce na teplotu nižší, než je očekávaná T_m (teplota tání) produktů (Obr. 5). Následně ohříváme reakční směs na teplotu vyšší, než je T_m, a zároveň detekujeme fluorescenci. Základní předpoklad je, že fluorescenční aktivita interkalačního barviva (SYBR Green, LC Green, Eva Green a ResoLight) je přímo úměrná množství dvouvláknové DNA přítomné v reakční směsi. Vynesení naměřené intenzity fluorescence proti příslušné poté zobrazuje křivku tání, která strmě klesá v okolí T_m. Po derivaci křivky tání se teplota v inflexním bodě v grafu zobrazí jako vrchol „peaku". Při použití interkalačních barviv se využívá předpokladu, že nespecifické produkty mají odlišnou T_m než produkty specifické. Některá interkalační barviva se mohou vázat i na jednovláknovou DNA, ale taková nejsou pro HRM používána.

Obr. 5. Závislost denaturace dvouvláknové DNA na hodnotě fluorescence

(přepracováno podle: Gudrun, 2007)
Separace dvouvláknové DNA je závislá na délce řetězce, obsahu nukleotidů G/C, sekvenci, iontové síle, koncentraci DNA a přítomnosti látek, jako je např. dimethyl sulfoxid (Musso et al., 2006). I jedinou substituci nukleotidu lze odlišit prostřednictvím HRM. Při tvorbě heteroduplexů (chybné párování), nekomplementarita způsobuje sníženou afinitu řetězců a to má za následek denaturaci DNA při nižší teplotě, která je snadno identifikovatelná (Obr. 6). Při HRM dochází k zahřívání produktu po PCR reakci. Jakmile se teplota zvyšuje a duplexy procházejí teplotními změnami, dochází k uvolňování barviva a redukci fluorescence. Změna Tm je poměrně velká (0,8–1,4 °C) a tvar křivky je hodně odlišný. Homoduplexy tvoří velmi podobné křivky, které jsou blízko sebe. Pokud dojde k záměně A za T nebo C za G a naopak, jsou změny Tm velmi malé (méně než 0,4 °C) a nemusí dojít k odlišení jednotlivých vzorků (Grievink & Stowell, 2008; Gundry et al., 2003; Liew et al., 2004).


Obr. 6. Křivka tání DNA

Při tvorbě heteroduplexů mají křivky jiný tvar a po derivaci křivky tání lze produkty snadno odlišit.