Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová

4diskuze

Z klinického hlediska představuje pojem rezistence na ASA selhání léčby, kdy užívání ASA nezabránilo další trombotické příhodě. Četnost výskytu akutního infarktu myokardu je u léčených pacientů 5–45 % (Akay et al., 2009). Laboratorně znázorňuje pojem rezistence na ASA nemožnost prokázat inhibici destičkových funkcí in vitro při užívání ASA. U těchto pacientů se neúčinnost léčby ASA pohybuje v rozmezí 5–60 % (Shenkman et al., 2008), tato variabilita je dána rozdílnými metodikami posuzování ASA rezistence. Rezistence ASA je tak popsána jako variabilita mezi pacienty a zdravými jedinci v závislosti na laboratorních testech, které monitorují účinnost podávané protidestičkové léčby (Mueller et al., 1997; Eikelboom et al., 2002; Gum et al., 2003). Podle našich měření byla zjištěna nedostatečná účinnost protidestičkové léčby s využitím impedanční agregometrie u 34,4 % pacientů (Obr. 15) v souboru 90 pacientů s akutním infarktem myokardu.

Jelikož jsou příčiny rezistencí multifaktoriální, využívá se pro jejich stanovení mnoho detekčních metod. V posledních letech se měření agregace destiček provádí prostřednictvím perspektivní metody optické transmisní agregometrie (LTA) v plazmě bohaté na krevní destičky (Cattaneo et al., 2007). Problém však představuje nedostatečná standardizace v oblasti volby induktoru a následný výběr vhodné koncentrace induktoru (Mehta & Mohandas, 2010). Měření agregace zajišťuje také test VerifyNow, jehož výsledky korelují s výsledky LTA (Homoncik et al., 2000).

Další možností vyšetření je detekce 11-dehydrotromboxanu B₂ v moči nebo séru, které umožňuje pouze stanovení aspirinové rezistence. Tento test je však časově náročný a jeho výsledky mohou být ovlivněny výskytem tohoto metabolitu z mimodestičkových zdrojů, jako jsou buňky endotelu, leukocyty a ledvinová tkáň (Frelinger et al., 2006). Reaktivitu destiček lze zjistit měřením času, který je potřebný k uzavření membrány pomocí PFA-100. Výhodou tohoto testu je simulace podmínek in vivo. Použití testu pro zjištění aspirinové rezistence však není ideální, neboť závisí na výběru vhodného induktoru reakce (Hézard et al., 2002).

Vyšetření agregace krevních destiček lze požadovat za nejčastěji využívanou metodu pro vyšetření funkce destiček. Jedna z možností určení reziduální agregace krevních destiček je použití vícekanálové impedanční agregometrie (MEA). Výhodou tohoto funkčního testu je simulace in vivo podmínek primární hemostasy a standardizace provedená výrobcem. Proto jsme tento test vybrali pro vyšetření agregační schopnosti krevních destiček a její ovlivnění léčbou pomocí ASA.

Nejprve bylo nutno metodu optimalizovat a zjistit účinnost in vitro testů. Jako induktory agregační reakce byly vybrány epinephrin, kolagen a kyselina arachidonová. Ukázalo se, že epinephrin a kyselina arachidonová dostatečně aktivují destičky v závislosti na jejich koncentraci. Jelikož reakce krevních destiček byla viditelně citlivější u kyseliny arachidonové (Obr. 9), byl tento induktor dále používán v plné koncentraci. Další krok optimalizace bylo stanovení cut-off pro ASPItest, který je citlivý k blokaci cyklooxygenasy. Hodnota určující účinnost protidestičkové léčby byla porovnána s hodnotou určenou na skupině 40 zdravých dárců krve (Ulehlová et al., 2011). Rozmezí hodnot agregace těchto jedinců bylo 200–956 AUC. Tuto hodnotu lze porovnat s rozmezím 325–1140 AUC, která byla stanovena na skupině 57 dárců krve (Mueller et al., 2008). Odlišnost hodnot je určena rozdílným použitím protisrážlivé látky při odběru krve, kdy je hodnota agregace při odběru do citrátu sodného (200 AUC) nižší oproti odběru do hirudinu (325 AUC). Aplikace naměřeného rozpětí dále sloužila jako hranice normálního rozmezí. Pokud byla hodnota agregace vyšší než 200 AUC, hodnotili jsme protidestičkovou léčbu jako neúčinnou.

Měření agregační schopnosti krevních destiček je funkční test, který umožňuje sledovat průběh aktivace destičky. Podmínky reakce se velice přibližují podmínkám in vivo. Proto bylo měření agregace využito pro hledání příčiny selhání protidestičkové léčby. Při tomto pilotním měření byla ASA in vitro přidána ke vzorku plné krve. Na začátku jsme hledali čas potřebný k inhibici destiček. Pro měření jsme použili pool získaný z vzorků krve 7 pacientů. Pro zajištění dostatečné intenzity inhibiční reakce byl optimalizován časový parametr, kdy s dostatečnou rezervou byl pro další experiment použit čas 5 minut (Obr. 10). Dále bylo optimalizováno koncentrační rozmezí ASA, které bude poskytovat možnost sledovat závislost množství přidané ASA in vitro na hodnotě agregace. Vycházeli jsme z teoretického výpočtu běžné denní dávky 100 mg ASA za předpokladu 100% utilizace léku. Z našich měření jsme zjistili, že i poloviční dávka ASA 50 mg dostačuje k inhibici krevních destiček (Obr. 11), což je v souladu s řadou literárních zdrojů, které potvrzují zejména výsledky studií Weksler et al., 1985, a Hegalson et al., 1993, které prezentují, že i denní dávka 40 mg postačuje k efektivnímu snížení agregace krevních destiček.

Výsledky in vitro testů ASA nám pomohly v charakterizaci destičkového receptoru COX–1. Příčiny selhávání protidestičkové léčby u pacientů, kteří reagují na in vitro dávku ASA odpovídající 100 mg, jsou exogenní – non-compliance, porucha vstřebávání a rychlý obrat destiček. Zatímco u pacientů, kteří nereagují na in vitro dávku ASA odpovídající 100 mg, lze předpokládat poruchu receptoru. Většina pacientů reagovala na dávku adekvátní podání 100 mg ASA in vivo v in vitro testování. Příčiny selhávání protidestičkové léčby proto můžeme zařadit mezi exogenní. Pro zajištění účinnosti používané terapie je důležité zvýšit dávku léčiva. U jednoho pacienta jsme prokázali neschopnost destičky reagovat na běžnou denní dávku ASA. K změně agregace destičky dochází až při velmi vysoké dávce ASA (Obr. 20). Pomocí in vitro testování jsme takto mohli odlišit pacienta, u kterého léčba selhává z endogenních příčin. V tomto případě je velice důležité změnit typ léčby a tím předejít dalšímu infarktu myokardu.

Selhání protidestičkové léčby se jeví jako závažný klinický problém. Z tohoto důvodu patří detekce příčin selhání léčby ke klíčovým faktorům prevence aterotrombotických příhod. Příčiny selhání protidestičkové terapie jsou exogenní a endogenní (Michelson et al., 2005). Mezi exogenní příčiny patří neužívání předepsaného léku, omezená absorpce ASA, nedostatečná dávka ASA, současné užívání nesteroidních léků, bránících vazbě ASA na vazné místo COX–1, kouření, zvýšená tvorba adrenalinu vlivem stresu nebo fyzické námahy, věk i pohlaví, hyperlipidémie, hyperglykémie a zvýšený obrat krevních destiček. Endogenní příčiny selhávání protidestičkové léčby jsou zobrazeny v Tab. 12.

Podíl jednotlivých exogenních a endogenních faktorů na selhávání protidestičkové terapie se odlišuje se zřetelem na použitý lék, jeho metabolizaci a na genetické predispozice pacienta. ASA je v zažívacím traktu relativně dobře metabolizována, zatímco u clopidogrelu je pouze 15 % léčiva v konečné fázi přeměněno na aktivní metabolit. Většina účinného léku je metabolizována na neaktivní metabolity prostřednictvím esteras. Jedním z předpokladů vzniku kardiovaskulárních nemocí je výskyt polymorfismů destičkových receptorů nebo jejich enzymů. Celkem bylo již identifikováno 50 polymorfismů v 11 genech (Goodman et al., 2008). V naší práci jsme stanovili frekvenci výskytu polymorfismu destičkového receptoru COX–1 (842A > G), který zvyšuje u pacientů riziko krvácení u infarktu myokardu. Výskyt polymorfismu jsme zjistili u 7 % ze souboru 90 pacientů s akutním koronárním syndromem, což je o 5 % méně než ve skupině 1450 dárců krve ve studii Kvasnička et al., 2009. Ačkoli přítomnost polymorfismu destičkových receptorů v genetické výbavě člověka nepatří mezi hlavní rizikové faktory (výskyt 7 %) v porovnání s neúčinností protidestičkové léčby, která představuje 34,4 % stejného souboru pacientů, podařilo se nám prokázat signifikantní závislost mezi přítomností mutačního stavu destičkového receptoru a selháním protidestičkové léčby (p = 0,040). Navíc s využitím in vitro testování s ASA lze odlišit pacienty, u nichž léčba selhává z exogenních příčin. Pro zajištění účinné prevence stačí navýšit množství denní dávky ASA. Selhávání protidestičkové léčby z důvodu přítomnosti polymorfismu není tak časté.

Z tohoto pohledu je velmi důležité, hledat příčiny selhání protidestičkové terapie, abychom zajistili účinnou sekundární prevenci u rizikových pacientů s využitím in vitro inkubace s ASA. Odlišné výsledky prací (Kvasnička et al., 2009; Maree et al., 2005), které sledují význam vlivu genetických změn destičkových glykoproteinů, jsou dány velikostí souborů vyšetřovaných jedinců, zastoupením odlišných etnických skupin, velkým množství činitelů vnějšího prostředí, které s genetickými vlivy interagují různým způsobem a zejména rizikovostí našeho souboru pacientů s prodělaným infarktem myokardu.