Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová

5závěr

Cílem práce bylo zhodnocení podílu krevních destiček na vzniku kardiovaskulárních onemocnění a možné farmakologické ovlivnění rozvoje onemocnění ve formě akutního infarktu myokardu prostřednictvím protidestičkové terapie. Dle literatury byl zhodnocen vliv exogenních a endogenních příčin selhávání protidestičkové terapie pomocí ASA.

Zjištění účinnosti používané protidestičkové léčby bylo zhodnoceno funkčním testem založeným na měření agregace krevních destiček, který byl nejprve optimalizován. Byla stanovena efektivita používané protidestičkové léčby jako agregace vyšší než 200 AUC, které bylo dosaženo u 65,6 % pacientů s rizikem manifestace akutní koronární příhody. Zbylá část 34,4 % pacientů byla rezistentní na léčbu.

K detekci potenciálních příčin (endogenních vs. exogenních) selhání protidestičkové léčby byla modifikována metoda impedanční agregometrie s aktivátorem kyselinou arachidonovou pro in vitro inkubaci vzorku s ASA. Toto pilotní měření se po provedené optimalizaci osvědčilo jako spolehlivá metoda k určení příčin selhání používané terapie, kdy jasně odlišíme pacienty neodpovídající in vitro na dávku ASA 100 mg ani na dávku 5krát vyšší, což není in vivo aplikovatelná dávka. Z toho plyne, že léčba ASA in vivo nedosáhne úspěchu a je nutné změnit léčebnou strategii.

Z endogenních příčin ASA rezistence jsme se zaměřili na změnu destičkového polymorfismu COX–1, v poslední době velmi sledovanou v odborné literatuře, který je spojován se zvýšenou aktivitou krevních destiček a rezistencí na léčbu ASA. Vyšetření polymorfismu bylo optimalizováno (koncentrace Mg²⁺, nastavení melting programu a využití spikování vzorku pro vyšší robustnost výsledků) pro užití v rutinní diagnostice na základě spikování vzorků pro rozlišení jednotlivých mutačních stavů. Z našich výsledků vyplývá, že výskyt polymorfismu nepatří mezi hlavní rizikové faktory v porovnání s neúčinností protidestičkové léčby, která představuje 34,4 % identického souboru pacientů. Podařilo se však prokázat signifikantní závislost mezi přítomností mutačního stavu destičkového receptoru a selháním protidestičkové léčby (p = 0,040). Zařazení inkubace s ASA povede k lepšímu výběru pacientů s geneticky podmíněnou změnou receptoru COX–1 než samotné vyšetření rezistence na ASA, které je zatíženo řadou endogenních faktorů ovlivňujících účinnost léčby ASA.

Tato práce umožnila otevřít nový pohled v diagnostice prevence kardiovaskulárních příhod. Lze předpokládat, že v budoucnu by tento přistup, založený na in vitro testování, mohl doplnit současné metody diagnostiky.

6literatura

Aherne T., Price D. C., Yee E. S., Hsieh W. R., Ebert P. A. (1986) Prevention of ischemia-induced myocardial platelet deposition by exogenous prostacyklin. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 92, 99–104.
Akay O. M., Canturk Z., Akin E., Bal C., Gulbas Z. (2009) Aspirin–resistance frequency: a prospective study in 280 healthy Turkish volunteers. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 15, 98–102.
Antithrombotic Trialists' Collaboration (2002) Colaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death, myocardial infarction, and stroke by prolonged antiplatelet therapy in high-risk patiens. BMJ 324, 71–86.
Bentfeld-Barker M. E., Bainton D. F. (1982) Identification of primary lysosomes in human megakaryocytes and platelets. Blood 59, 472–481.
Bizzozero G. (1882) Über einen neuen Formbestandtheil des Blutes und dessen Rolle bei der Thrombose und der Blutgerinnung. Virchows Arch. 90, 261–332.
Breugelmans J., Vertessen F., Mertens G., Gadisseur A., Der Planken M. V. (2008) Multiplate whole blood impedance aggregometry: a recent experience. Thromb. Haemost. 100, 725–726.
Bruhn H. D. (2003) Patofyziologie hemostatického systému. Patologická fyziologie (Fölsch U. R., Kochsiek K., Schmidt R. F., ed.), pp. 193–204, Grada Publishing, Praha.
Butkus A., Shirey E. K., Schumacher O. P. (1982) Tromboxane biosynthesis in platelets of diabetic and coronary artery diseased patients. Artery 11, 238–251.
Calatzis A., Wittwer M., Krueger B. (2004) A new approach to platelet function analysis in whole blood – the multiplate analyzer. Platelets 15, 479–517.
Cardinal D., Flower R. (1980) The eletronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood. J Pharmacol Methods 3, 135–158.
Cattaneo M., Lecchi A., Zighetti M. L., Lussana F. (2007) Platelet aggregation studies: autologous platelet–poor plasma inhibits platelet aggregation when added to platelet– rich plasma to normalize platelet count. Haematologica 92, 694–697.
Cines D. B., Pollak E. S., Buck C. A., Loscalzo J., Zimmerman G. A., McEver R. P., Pober J. S., Wick T. M., Konkle B. A., Schwartz B. S., Barnathan E. S., McCrae K. R., Hug B. A., Schmidt A. M., Stern D. M. (1998) Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood 91, 3527–3561.
Corash L., Shafer B. (1981) Platelet sizing: Value in quality control of platelet concentrates. Vox Sang. 40, 48–54.
Cuisset T., Frere C., Quilici J., Favorit B., Bali L., Poyet R., Faille D., Morange P. E., Alessi M. Ch., Bonnet J. L. (2009) Aspirin noncompliance is the major cause of „aspirin resistance“ in patients undergoing coronary stenting. Am. Heart J. 157, 889–893.
David-Ferreira J. F. (1964) The blood platelet: elektron microscopic studies. Int. Rev. Cytol. 17, 99–148.
Davies P. F. (1993) Endothelium as a signal transduction interface for flow forces: cell surface dynamics. Thromb. Haemost. 83, 124–128.
Djaldetti M., Fishman P., Bessler H., Notti I. (1979) SEM observations on the mechanism of platelet release from megakaryocytes. Thromb. Haemost. 31, 611–620.
Eikelboom J. W., Hirsh J., Weitz J. I., Johnston M., Yi Q., Yusuf S. (2002) Aspirin-resistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction, stroke, or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events. Circulation 105, 1650–1655.
Frelinger A. L., Furman M. I., Linden M. D., Li Y., Fox M. L., Barnard M. R., Michelson A. D. (2006) Residual arachidonic acid-induced platelet activation via an adenosine diphosphate-dependent but cyclooxygenase-1- and cyclooxygenase-2-independent pathway: a 700-patient study of aspirin resistance. Circulation 113, 2888–2896.
Ganong W. F. (1999) Přehled lékařské fysiologie, pp. 449–452, H & H, Jinočany.
Goodman T., Ferro A., Sharma P. (2008) Pharmacogenetics of aspirin resistance: a comprehensive systematic review. Br J Clin Pharmacol 66, 222–232.
Goodman T., Sharma P., Ferro A. (2007) The genetics of aspirin resistance. Int. J. Clin. Pract. 61, 826–834.
Grievink H., Stowell K. M. (2008) Identification of ryanodine receptor 1 single–nucleotide polymorphisms by high–resolution melting using the LightCycler 480 system. Anal. Biochem. 15, 396–404.
Gudrun H. R., Kent J. O., Wittwer C. T. (2007) High–resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics 8, 597–608.
Gundry C. N., Vandersteen J. G., Reed G. H., Pryor R. J., Chen J., Wittwer C. T. (2003) Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed–tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes. Clin. Chem. 49, 396–406.
Gum P. A., Kottke-Marchant K., Welsh P. A., White J., Topol E. J. (2003) A prospective, blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease. J. Am. Coll. Cardiol. 41, 961–965.
Harker L., Fuster V. (1986) Pharmacology of platelet inhibitors. J. Am. Coll. Cardiol. 8, 21B–32B.
Helgason C. M., Hoff J. A., Kondos G. T., Brace L. D. (1993) Platelet aggregation in patients with atrial fibrillation taking aspirin or warfarin. Stroke 24,1458–1461.
Heimark R. L., Kurachi K., Fijikawa K., Davie E. W. (1980) Surface activation of blood coagulation, fibrinolysis and kinin formation. Nature 286, 456–460.
Hemker H. C., Ecnouf M. P., Hemker P. W., Swart A. C., MacFarlane R. G. (1967) Formation of prothrombin converting activity. Nature 215, 248–251.
Hézard N., Metz D., Nazeyrollas P., Droullé C., Potron G., Nguyen P. (2002) PFA-100 and flow cytometry: can they challenge aggregometry to assess antiplatelet agents, other than GPIIbIIIa blockers, in coronary angioplasty? Thromb. Res. 108, 43–47.
Hilmerová J., Filipovský J. (2004) Klinický význam aspirinové rezistence. Vnitř. lék. 50, 462–469.
Homoncik M., Jilma B., Hergovich N., Stohlawetz P., Panzer S., Speiser W. (2000) Monitoring of aspirin (ASA) pharmacodynamics with the platelet function analyzer PFA-100. Thromb. Haemost. 83, 316–321.
Huang E. M., Detwiler T. C. (1980) Reassessment of the evidence for the role of secreted ADP on human platelet aggregation. J. Lab. Clin. M. 95, 59–68.
Hynie S. (2001) Speciální farmakologie. Díl 4. Látky ovlivňující kardiovaskulární systém, pp. 242–246, Karolinum, Praha.
Ihzumi T., Hattori A., Sanada M., Muto M. (1997) Megakaryocyte and platelet formation: a scanning electron microscope study in mouse spleen. Arch Histol Jpn 40, 305–320.
Karetová D., Bultas J. (2005) Rezistence na aspirin – laboratorní odchylka nebo klinický problém? Medicína pro praxi 2, 49–52.
Kosaki G. (2005) In vivo platelet production from mature magakaryocytes: Does platelet release occur via proplatelets. Int. J. Hematol. 81, 208–219.
Koteliansky V. E., Leytin V. L., Sveridov D. D., Repin V. S., Smirnov V. N. (1981) Human plasma fibronectin promotes the adhesion and spreading of platelets on the surfaces coated with fibrilar collagen. FEBS Lett. 123, 59–62.
Kubisz P., Hrubišková K., Pařízek M., Holan J. (1987) Trombocyty a trombocytopatie, pp. 17–79, Vydavatelstvo Osveta, Martin.
Kvasnička J., Hájková J., Bobčíková P., Křížová P., Dušková D., Poletínová Š., Kieferová V., Zenáhlíková Z., Pecen L. (2009) Polymorfismy genu destiček spojované s aterotrombogenezí a jejich výskyt ve zdravé české populaci středního věku. Cor Vasa 51, 187–193.
Leung L., Nachman R. (1986) Molecular mechanismus of platelet aggregation. Annu. Rev. Med. 37, 179–186.

Liew M., Pryor R., Palais R., Meadows C., Erali M., Lyon E., Wittwer C. (2004) Genotyping of single–nucleotide polymorphisms by high–resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50, 1156–1164.

Lingjaerde O. (1984) Blood platelets as a model system for studying the biochemistry of depression. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 99–111.
Lüllmann H., Mohr K., Wehling M. (2009) Toxikologie a farmakologie, pp. 170–352, Grada Publishing, Praha.
Maree A. O., Curtin R. J., Chubb A., Dolan C., Cox D., O‘Brien J., Crean P., Shields D. C., Fitzgerald D. J. (2005) Cyclooxygenase–1 haplotype modulates platelet response to aspirin. J. Thromb. Haemost. 3, 2340–2345.
Matýšková M., Zavřelová J., Hrachovinová I. (1999) Hematologie pro zdravotní laboranty. 2. díl. Krevní srážení, pp. 14–195, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, Brno.
Mehta J., Mohandas B. (2010) Aspirin resistance? Fact or fiction? A point of view. World J Cardiol 26, 280–288.
Michelson a. D., Cattaneo M., Eikelboom J. W., Gurbel P., Kottke-Marchant K., Kunicki T. J., Pulcinelli F. M., Cerletti C., Rao A. K. (2005) Aspirin resistance: position paper of the Working group on aspirin resistance. J. Thromb. Haemost. 3, 1309–1311.
Mueller M. R., Salat A., Stangl P., Murabito M., Pulaki S., Boehm D., Koppensteiner R., Ergun E., Mittlboeck M., Schreiner W., Losert U., Wolner E. (1997) Variable platelet response to low-dose ASA and the risk of limb deterioration in patients submitted to peripheral arterial angioplasty. Thromb. Haemost. 78, 1003–1007.
Mueller T., Dieplinger B., Poelz W., Haltmayer M. (2008) Utility of the PFA-100 instrument and the novel Multiplate analyzer for the assessment of aspirin and clopidogrel effects on platelet function in patients with cardiovascular disease. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 15, 652–659.
Murray R. K., Harfenist E. J. (2002) Plasmatické proteiny, imunoglobuliny a krevní koagulace. Harpenova biochemie (Kraml J., ed.), pp. 713–724, H & H, Jinočany.

Musso M., Bocciardi R., Parodi S., Ravazzolo R., Ceccherini I. (2006) Betaine, dimethyl sulfoxide, and 7-deaza-dGTP, a powerful mixture for amplification of GC-rich DNA sequences. J Mol Diagn 8, 544-550.

Nemerson Y. (1988) Tissue factor patway of blood coagulation. Blood 71, 1–8.
Nosáľ R., Jančinová V. (1990) Krvné doštičky v biológii a medicíne, pp. 19–176, Vydavateľstvo Slovenskej akademie vied, Bratislava.
Novák F. (2002) Úvod do klinické biochemie, pp. 17–50, Karolinum, Praha.
Omenn G. S., Smith L. T. (1987) A common uptake system for serotonin and dopamine in human platelets. J. Clin. Invest. 62, 235–240.
Patel S., Hartwig J., Italiano J. (2005) The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J. Clin. Invest. 115, 3348–3354.
Pecka M. (2004) Laboratorní hematologie v přehledu, pp. 26–230, Finidr, Český Těšín.
Pecka M. (2010) Preanalytická fáze. Praktická hematologie, (Pecka M., ed.), pp. 43–55, Finidr, Český Těšín.
Poredoš P. (2001) Endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 7, 276–280.
Povýšilová V., Šteiner I. (2007) Patologie oběhového ústrojí. Speciální patologie, (Houdek L., ed.), pp. 1–28, Galén a Karolinum, Praha.
Roth G. J., Stanford N., Majerus P. W. (1975) Acetylation of prostaglandin synthase by aspirin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 3073–3076.
Ruggeri Z. M., De Marco L., Gatti L., Bader R., Montgomery R. R. (1983) Platelets have more than one binding site for von Willebrand factor. J. Clin. Invest. 72, 1–12.
Shaklai M., Tavassoli M. (1978) Demarcation membrane system in rat megakaryocyte and the mechanism of platelet formation: a membrane reorganization process. J. Ultrastruct. Res. 62, 270–285.

Shenkman B., Matetsky S., Feper P., Hod H., Einav Y., Lubetsky A., Varon D., Avion N. (2008) Variable responsiveness to clopidogrel and aspirin among patients with acute coronary syndrome as assessed by platelet functions tests. Thromb. Res. 122, 336–345.

Shattil S. J., Bennett J. S. (1981) Platelets and their membranes in hemostasis: physiology and pathophysiology. Ann. Int. Med. 94, 108–118.
Sottile J., Mosher D. F., Fullenweider J., George J. N. (1989) Human platelets contain mRNA transcripts for platelet factor 4 and actin. Thromb. Haemost. 62, 1100–1102.
Tóth O., Calatzis A., Penz S., Losonczy H., Siess W. (2006) Multiple electrode aggregometry: a new device to measure platelet aggregation in whole blood. Thromb. Haemost. 96, 781–788.
Trávníčková E. (2003) Fyziologie krve. Lékařská fyziologie (Trojan S., Langmeier M, ed.), pp. 140–151, Grada Publishing, Praha.
Ulehlová J., Slavík L., Krčová V., Hutyra M., Galuszka J., Indrak K. (2011) The assessment of aspirin resistance by using light transmission and multiple electrode aggregometry. Int J Lab Hematol 33, 305–309.
Vrbacký F. (2010) Cytogenetické a molekulárně genetické metody. Praktická hematologie, (Pecka M., ed.), pp. 311–321, Finidr, Český Těšín.
Weiss H., Turitto V. T., Baumgartner H. R., Nemerson Y., Hoffmann T. (1989) Evidence for the presence of tissue factor activity on subendotelium. Blood 73, 968–975.
Weksler B. B., Kent J. L., Rudolph D., Scherer P. B., Levy D. E. (1985) Effects of low dose aspirin on platelet function in patients with recent cerebral ischemia. Stroke 16, 5–9.
Wright J. (1906) The origin and nature of blood platelets. Boston Med. Surg. J. 154, 643–645.
Yamada E. (1957) The fine structure of the megakaryocyte in the mouse spleen. Acta Anat 29, 267–290.

7seznam použitých zkratek

ADP adenosindifosfát

AMP adenosinmonofosfát

ASA kyselina acetylsalicylová

cAMP cyklický adenosinmonofosfát

cGMP guanosinmonofosfát

c–MPL specifický receptor megakaryocytu

DAG 1,2-diacylglycerol

DMS vymezení membránového systému

DTS denzní tubulární systém

Faktor I fibrinogen

Faktor II protrombin

Faktor III tkáňový tromboplastin

Faktor IV vápenaté ionty

Faktor IX Christmasův faktor

Faktor V proakcelerin

Faktor VII prokonvertin

Faktor X Stuartův-Prowerův faktor

Faktor XI Plasma Tromboplastin Antecedent

Faktor XII Hagemanův faktor

Faktor XIII fibrin stabilizující faktor

Faktor XIV protein C

Fb fibronectin

HDL lipoproteiny s vysokou denzitou

HMWK kinogen o vysoké molekulové hmotnosti

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HRM high resolution melting (vysokorozlišovací analýza křivek tání)

ICAM-1,2,3 adhezivní molekula podobná Ig

IP₃ inositol 1,4,5-trifosfát

LDL lipoproteiny s nízkou denzitou

LTA optická transmisní agregometrie

MEA vícenásobná impedanční agregometrie

MPV mean platelet volume (střední objem krevních destiček)

OKS kanikulární systém

PDGF destičkový růstový faktor

PF3 destičkový faktor 3

PF4 destičkový faktor 4

PGG₂, PGH₂, PGE₂, PGD₂ prostaglandiny

PGI₂ prostacyklin

PCR polymerázová řetězová reakce

SNPs single–nucleotide polymorphisms

RT PCR PCR v reálném čase

VCAM-1 adhezivní molekula cévních buněk

TFPI inhibitor tkáňového faktoru

T_m teplota tání

TXA₂ tromboxan A₂

VLDL lipoproteiny s nízkou denzitou

vWF von Willebrandův faktor

WT wild type