Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová

Experimentální část

2MATERIÁL A METODY

2.1Pracovní roztoky

• 
  arachidonová kyselina (Dynabyte, Mnichov, Německo, konečná koncentrace 0,16 mg/ml)
  
• 
  kolagen (American Biochemical & Pharmaceuticals Ltd., UK, konečná koncentrace 1mg/ml)
  
• 
  epinephrine (American Biochemical & Pharmaceuticals Ltd., UK, konečná koncentrace 100 μM/ml)
  
• 
  0,9% roztok NaCl
  
• 
  70% ethanol
  
• 
  100% isopropanol
  
• 
  LightCycler 480 Genotyping Master^® (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo)
  
  • 
    MasterMix – FastStartTaqDNAPolymerase, reakční pufr, dNTPmix (s UTP náhradou za dTTp) a HighResolutionMelting
    
  • 
    roztok MgCl₂, 25 mM
    
  • 
    primer COX1 R LC, 100μM 5`–TTTCTAGCCCTCAGTATTCTCAT–3
    
  • 
    primer COX1 F LC, 100μM 5`–CCTTCCGATAACTGAGCACCT–3
    
  • 
    tris pufr 10 mM, pH 8
    

2.2Chemikálie

• 
  Gentra puregene blood kit (Qiagen, Minneapolis, USA)
  
  • 
    RBC lysis solution
    
  • 
    Cell lysis solution
    
  • 
    Protein precipitation solution
    
  • 
    DNA hydration solution
    
• 
  LightCycler 480 Genotyping Master^® (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo)
  
• 
  acetylsalicylová kyselina (Acylpyrin 100: Herbacos-bofarma s.r.o., Pardubice, ČR)
  

2.3Materiál a přístrojová technika

• 
  Multiplate^® analyzer (Dynabyte, Mnichov, Německo)
  
• 
  LightCycler 480 instrument™ (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo)
  
• 
  analytické váhy (Boeco, Hamburk, Německo)
  
• 
  Centrifuga MEGAFUGE 1.0 R (Heraeus)
  
• 
  Centrifuga BIOFUGE 22R (Heraeus)
  
• 
  Centrifuga Z 323 K (Hermle)
  
• 
  Stolní centrifuga 5424 (Eppendorf)
  
• 
  Stolní mikrocentrifugy Spectrafuge Mini (Labnet International, Inc.)
  
• 
  Spektrofotometr NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies)
  
• 
  zkumavky a jehly VACUETTE^® s obsahem citrátu sodného, koncentrace 0,109 mol/l (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Rakousko)
  
• 
  zkumavky VACUETTE® s obsahem hirudinu, koncentrace 15 IU/ml (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Rakousko)
  
• 
  automatické pipety 0,1–1 μl, 10 μl; 20 μl; 100 μl; 200 μl; 1000 μl (Eppendorf AG, Hamburk, Německo)
  
• 
  Pasteurovy pipety 3 ml (East Port)
  
• 
  zkumavky 0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml (Sarstedt)
  
• 
  destičky LightCycler® 480 Multiwell Plate (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo)
  
• 
  laboratorní plast a sklo
  
• 
  ledničky (4–8 °C) a mrazicí boxy (-20 °C, -80 °C)
  
• 
  vortex REAX Control (Heidolph)
  
• 
  biologický termostat BT 120 (LAB systém)
  

2.4Biologický materiál

• 
  DNA izolovaná z periferní krve pacientů
  
• 
  nesrážlivá krev s přídavkem citrátu sodného (0,109 mol/l)
  
• 
  nesrážlivá krev s přídavkem hirudinu (15 IU/ml)
  

2.5Charakteristika souboru pacientů

2.6Preanalytická příprava biologického materiálu

2.6.1Příprava pacienta před odběrem

• 
  Odběr nalačno (12 h před odběrem se doporučuje nejíst, nepít slazené nápoje, nekouřit a nekonzumovat alkoholické nápoje).
  
• 
  Doba odběru ráno (z důvodu značné kolísavosti množství látek a počtu krvinek v krevní plazmě během dne).
  
• 
  Údaje o léčbě pacienta dodané ošetřujícím lékařem nebo příslušným zdravotnickým zařízením (antikoagulační léčba, protidestičková léčba).
  

Při odběru byly použity zkumavky s obsahem antikoagulačních látek. Pro izolaci DNA z plné krve se byly využity zkumavky s přídavkem citrátu sodného (0,109 mol/l), který vyvazuje vápenaté ionty a chrání labilní prokoagulační faktory. Pro stanovení agregační schopnosti krevních destiček byl jako antikoagulant použit hirudin (15 IU/ml), který zabraňuje genezi trombinu a nevyvazuje vápenaté ionty.

Důležité podmínky pro získání spolehlivých a srovnatelných výsledků jsou správný odběr, skladování, transport vzorku, identifikace vzorku, kontrola vzorku, subjektivní vliv personálu (dodržování metodických postupů, správné pracovní návyky), správná funkce a kalibrace přístrojů, kvalitní diagnostické sety a reagencie, kalibrace používané metody, vyhodnocení naměřených parametrů a jejich správná interpretace, vnitřní a vnější kontrola kvality (Pecka, 2010).

2.7Impedanční agregometrie

Vlastní měření probíhá v reakční kyvetě, která obsahuje dvojici nezávislých senzorů, čímž je zajištěna vysoká spolehlivost testu. Každý senzor je složen ze dvou vysoce vodivých měděných drátků potažených stříbrem. Reakce je iniciována naředěním hirudinové plné krve fyziologickým roztokem (0,9% NaCl) v poměru 1:2. Následují 3 minuty inkubace reakční směsi za stálého míchání v měřicí kyvetě na konstantní teplotu 37 °C. Samotná agregační reakce je iniciována přidáním 12 μl kyseliny arachidonové o koncentraci 15 mg/ml, která plní funkci induktoru. Takto dochází k přilnutí aktivovaných destiček k povrchu senzorů, která je detekována změnou elektrického odporu mezi dvěma elektrodami. Zvýšení elektrického odporu je průběžně zaznamenáno. Z jednoho měřicího kanálu se takto získají dva výstupy (křivky). Křivka udává závislost agregace destiček, která je vyjádřená v agregačních jednotkách [AU], na čase [min]. Jednotlivé hodnoty sledovaných parametrů jsou vypočteny z průměrných hodnot obou křivek:

• 
  plocha pod křivkou AUC [AU/min],
  
• 
  maximální amplituda agregace [AU],
  
• 
  maximální sklon agregace (hustota) [AU/min].
  

Obr. 7. Mechanismus aktivace krevní destičky pomocí vybraných receptorů

(přepracováno podle: http://www.multiplate.net/en/testresult.php)