Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová
|
|  Yüklə 2.28 Mb.
|
seznam obrázkůObr. 1. Schematické znázornění struktury krevní destičky 16 Obr. 2. Plazmatický koagulační systém 21 Obr. 3. Regulace metabolismu kyseliny arachidonové a účinky eikosanoidů 28 Obr. 4. Vzorec kyseliny acetylsalicylové 29 Obr. 5. Závislost denaturace dvouvláknové DNA na hodnotě fluorescence 32 Obr. 6. Křivka tání DNA 33 Obr. 7. Mechanismus aktivace krevní destičky pomocí vybraných receptorů 38 Obr. 8. Izolační protokol DNA pomocí Gentra puregene blood kit 39 Obr. 9. Vliv koncentrace induktoru na hodnotu agregace destiček 43 Obr. 10. Ovlivnění agregace destiček podmíněné časem inkubace ASA v plné krvi 44 Obr. 11. Stanovení in vitro inhibiční koncentrace ASA 45 Obr. 12. Sledování tvorby dimerů či přítomnosti aditiv v reakční směsi 46 Obr. 13. Graf křivky tání bez použití metody spikování vzorku 48 Obr. 14. Graf křivek tání s použitím metody spikování vzorků 48 Obr. 15. Zobrazení účinnosti protidestičkové léčby 49 Obr. 16. Procentuální zastoupení polymorfismu receptoru COX–1 50 Obr. 17. Zastoupení polymorfismu receptoru COX–1 v závislosti na pohlaví 51 Obr. 18. Výskyt polymorfismu receptoru COX–1 podmíněný věkem vyšetřovaných pacientů 51 Obr. 19. Porovnání závislosti mezi odpovědí na protidestičkovou léčbu a mutačním stavem receptoru COX–1 52 Obr. 20. Stanovení in vitro inhibiční koncentrace ASA u pacientů neodpovídajících na léčbu 56 seznam tabulekTab. 1. Jednotlivé typy polymorfismů, které souvisí s aspirinovou rezistencí 31 Tab. 2. Názvy a sekvence použitých primerů 40 Tab. 3. Příprava mixu na reakci v objemu 10 μl 40 Tab. 4. Nastavení LightCycler 480 instrument 40 Tab. 5. Hodnoty agregace v závislosti na koncentraci přidaného induktoru 42 Tab. 6. Závislost doby inkubace ASA na inhibici agregační schopnosti destiček 44 Tab. 7. Závislost koncentrace ASA in vitro na snížení agregační schopnosti krevní destičky 45 Tab. 8. Účinnost léčby pomocí ASA 49 Tab. 9. Zastoupení polymorfismu destičkového receptoru COX–1 50 Tab. 10. Přehled výsledků genotypizace a impedanční agregometrie 53 Tab. 11. Vliv množství ASA na agregační schopnost destiček in vitro 55 Tab. 12. Endogenní příčiny selhávání protidestičkové terapie ASA 60 cíle práce
tEORETICKÁ ČÁST1HemostasaHemostasa je životně důležitý proces, který umožňuje organismu zastavit krvácení při poranění a současně udržuje krevní řečiště v neporušeném stavu. Je to komplexní mechanismus, který zahrnuje buněčné i plasmatické systémy přítomné v krvi a cévní stěně. Je spojený s řadou pozitivních a negativních zpětných vazeb. K jeho aktivaci dochází efektivně jako odpověď na poškození cévy, kdy se vytvoří dočasná hemostatická zátka tvořená krevními destičkami. Definitivní sraženina vzniká zpevněním fibrinovými vlákny s následnou retrakcí. Je velmi důležité, aby mezi mnoha komplexními, vzájemně závislými systémy byla zachovávaná rovnováha mezi hypokoagulací (sklon ke krvácení) a hyperkoagulací (nadměrné srážení) (Matýšková et al., 1999; Ganong, 1999). Mezi hlavní složky hemostasy patří:
1.1Cévní stěnaCévy neslouží jenom jako hlavní rozvaděč okysličené krve k jednotlivým orgánům a tkáním těla, ale mají důležitou funkci i při hemostatických dějích. Největší podíl má právě endotel (kontaktní plocha s krevním řečištěm), který ovlivňuje vznik aterosklerosy a následně kardiovaskulárních onemocnění. Cévy se dělí na tepny (artérie), žíly (vény) a vlásečnice (kapiláry). Tepny mají silné a pružné stěny, které tvoří tři vrstvy: vnitřní (endotel), střední (hladké svaly, kolagenní vlákna a fibroblasty) a zevní (fibroelastické vazivo, cévy vyživující artérie). Díky své struktuře cévy dobře vyrovnávají velký tlak při každém srdečním stahu. Jejich hladké svaly jsou řízeny nervovým systémem. Žíly neobsahují tolik svalových buněk jako tepny, a proto mají tenčí stěnu. Navíc vytvářejí chlopně, které zprostředkovávají směr toku krve z tkání do srdce. Vlásečnice mají cévní stěnu redukovanou na minimum a slouží k výměně plynů, živin a zplodin metabolismu mezi krví a tkáněmi (Pecka, 2004). Cévní stěnu tvoří intima, média a adventicia. Úloha cév v systému krevního srážení je mechanická (vazokonstrikce při poranění cévy), dále slouží jako místo syntézy a jako zásobárna mnoha látek, které se podílejí na hemostase. V neposlední řadě je místem interakce jednotlivých složek všech systémů hemostasy. 1.1.1Změna průsvitu cévyZúžení cévy (vazokonstrikce) ovlivňuje průtok krve v určitém místě (orgánu), čímž efektivně potlačuje krvácení v malých cévách. Dochází tak ke vzájemnému působení mezi nervovým systémem, svalovými buňkami a mediátory (serotonin, adrenalin, noradrenalin). Rozšíření cévy (vazodilatace) nastupuje za několik minut po vazokonstrikci. Slouží k rychlému odplavení hemostaticky aktivních látek, a tím efektivně udržuje srážení jen v místě poranění. Vyvolává ji oxid dusnatý, který se tvoří oxidací L-argininu. Vzniklý oxid dusnatý snadno difunduje z endotelu do hladkého svalu, kde aktivuje enzym guanylátcyklasu. Takto narůstá množství guanosin monofosfátu (cGMP), jehož přítomnost vyvolá pokles koncentrace vápníkových iontů (Ca2+) a vazodilataci. Potom proniká až do krevních destiček a inhibuje adhezi a agregaci. Hypoxie a poškození endotelu indukují relaxaci prostacyklinu a tím opět narůstá obsah oxidu dusnatého (Matýšková et al., 1999). 1.1.2EndotelEndotel reprezentuje funkční a dynamický povrch lumina cév. Jeho poškození je příčinou zánětu, trombosy a aterosklerosy. U dospělého člověka reprezentuje asi 1 % hmotnosti těla a plochu asi 1 m2. Mezi funkce endotelu patří usměrňování průtoku krve a permeability kapilár, proliferace buněk hladkého svalu i hemostasu. Jeho podíl na regulaci hemostasy je při vytváření a uvolňování řady biologicky aktivních látek nebo při zprostředkování exprese vazebných míst prokoagulačních i antikoagulačních faktorů na svém povrchu. Metabolismus endotelových buněk zahrnuje biosyntesu bílkovin, výměnu kyslíku, tekutin a makromolekul mezi krví a tkáněmi, zachovává rovnováhu mezi stimulací a inhibicí růstu cév, mezi zúžením a rozšířením cév, určuje adhezi krevních elementů a usměrňuje různé procesy hemostasy (Cines et al., 1998; Davies, 1993; Pecka, 2004; Poredoš, 2001). Aktivaci destiček kontrolují různé mechanismy:
Endotel usměrňuje hemostatické procesy aktivací proteinu C, tvorbou heparansulfátů a proteoglykanů (účinek na antitrombin) a uvolněním TFPI z endotelových buněk (Pecka, 2004). 1.1.3IntegrinyIntegriny jsou adhezivní receptory přítomné na povrchu některých buněk (endotel, krevní destičky, buňky hladkých svalů, leukocyty a fibroblasty). Jejich úkolem je vytvořit vazby mezi buňkami navzájem a buňkami a adhezivními proteiny. Tvoří je nekovalentně spojené α a β podjednotky. Vzájemné ovlivňování mezi krevními buňkami je důležité u procesů jako hemostasa, trombosa, hojení ran a zánětů. Integriny rozpoznávají řadu proteinů, které jsou nezbytně nutné při adhezi krevních destiček na subendotel poraněné cévy. Dělí se do tří skupin:
|