Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová
|
|  Yüklə 2.28 Mb.
|
2.8Genotypizace2.8.1Izolace DNA z leukocytůIzolace DNA byla provedena z leukocytů periferní krve pomocí Gentra puregene blood kit (Qiagen, Minneapolis, USA) dle protokolu uvedeného výrobcem (Obr. 8). Periferní krev byla lyzována pomocí RBC lysis solution, čímž došlo k odstranění erytrocytů. Následovalo 5 minut inkubace při laboratorní teplotě. Poté byla provedena centrifugace (10000 rpm / 25 °C / 3 min.). Supernatant byl odebrán pomocí Pasteurovy pipety a přidáním 300 μl Cell lysis solution a vložením na 1 minutu do ledu došlo k lýze buněk. Ke směsi bylo přidáno 100 μl Protein precipitation solution a následovalo vortexování po dobu 20 s. Poté centrifugace směsi (10000 rpm / 25 °C / 3 min.). Supernatant byl pomocí Pasteurovy pipety přetažen do čisté ependorfky a k němu bylo přidáno 300 μl isopropanolu. Při mírném míchání bylo možné pozorovat vznik vlákna DNA. Směs byla centrifugována (10000 rpm / 25 °C / 3 min.) a supernatant byl vylit rychlým pohybem. Přečištění DNA bylo provedeno 70% ethanolem s následnou centrifugací (10000 rpm / 25 °C / 3 min.) a odlitím supernatantu. Po vysušení při pokojové teplotě byla DNA rozpuštěna v 50 μl DNA Hydration solution). 
Obr. 8. Izolační protokol DNA pomocí Gentra puregene blood kit (přepracováno podle: Gentra puregene handbook)
2.8.2High resolution melting PCRPolymorfismus –842A > G (rs 10306114) genu pro cyklooxygenasu byl detekován ve vzorcích DNA, které byly získány izolací z periferní krve na analyzátoru LightCycler 480 instrument™ s využitím specifických primerů pro LightCycler 480 Genotyping Master® (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) dle protokolu výrobce (Tab. 3), který byl dále optimalizován (Tab. 4). Pro stanovení polymorfismu byla využita PCR v reálném čase, která je známá jako analýza teploty tání. Výhodou tohoto stanovení je možnost detekce přímo v PCR zkumavce či kapiláře bezprostředně po amplifikaci, aniž dojde k otevření reakční zkumavky. Takto je snížena nejen potřeba manipulace se vzorkem, ale výrazně klesá riziko kontaminace. Po amplifikaci jednotlivých úseků DNA následovala analýza pomocí HRM, která využívá klasické PCR reagencie a fluorescenční interkalační barvivo (ResoLight), jež se váže přímo na dvouvláknovou DNA. HRM detekuje sekvenční variabilitu DNA pomocí měření změn tání DNA duplexů. Nejprve dochází k amplifikaci požadovaného úseku DNA prostřednictvím PCR reakce. Poté byl produkt ochlazen na 40 °C a následovala aplikace teplotního gradientu, při kterém se duplexy rozvolňují, čímž dochází k uvolňování interkalačního barviva a redukci fluorescence. Normální genotyp (wild-type) a homozygoti se příliš neliší v množství uvolněného interkalačního barviva a lze je odlišit pouze podle jejich teploty tání. Heterozygoti tvoří heteroduplexy (větší obsah barviva). Proto heterozygoti poskytují rozdílnou křivku tání a jsou více odlišní než homozygoti (Vrbacký, 2010). Sekvence použitých primerů jsou uvedeny v Tab. 2. Výsledná data měření byla vyhodnocena s použitím LightCycler 480 Gene Scanning Software. Tab. 2. Názvy a sekvence použitých primerů
Tab. 3. Příprava mixu na reakci v objemu 10 μl
Tab. 4. Nastavení LightCycler 480 instrument
|