Detekce příčin rezistence protidestičkové léčby u rizikových pacientů diplomová práce autor: Bc. Terezie Haitlová
|
|  Yüklə 2.28 Mb.
|
3VÝSLEDKY3.1Optimalizace MEA3.1.1Stanovení vhodného induktoru agregaceVyšetření agregační schopnosti krevních destiček bylo provedeno pomocí přístroje Multiplate. Vlastní agregační reakci lze vyvolat přidáním vhodného induktoru. Nejprve bylo nutné nelézt induktor, který je citlivý k blokaci cyklooxygenasy. Na základě odborných poznatků jsme zvolili počáteční koncentrace induktorů, které byly naředěny 5x, 10x a 20x (Tab. 5). Jako nejvíce citlivý aktivátor agregace byla vybrána kyselina arachidonová. Po jejím přidání do reakčního roztoku bylo možno detekovat hodnotu agregace v největším rozsahu v závislosti na její koncentraci (Obr. 9). Krevní destičky reagovaly na změnu koncentrace epinephrin, ale v menším rozmezí na rozdíl od kyseliny arachidonové. Kolagen viditelně není citlivý pro tento test, neboť po snižování jeho koncentrace zůstala hodnota agregace téměř nezměněna. Z důvodu zajištění dostatečného impulsu k aktivaci destiček, byla kyselina arachidonová použita pro další měření v plné koncentraci. Tab. 5. Hodnoty agregace v závislosti na koncentraci přidaného induktoru
Obr. 9. Vliv koncentrace induktoru na hodnotu agregace destiček 3.1.2Stanovení doby inkubace ASA v krvi in vitroMěření agregační schopnosti krevních destiček je funkční test, který umožňuje sledovat průběh aktivace destičky. Podmínky reakce se proto velice přibližují podmínkám in vivo. Proto byla detekce agregace použita k hledání příčiny selhání protidestičkové léčby. Při tomto pilotním měření byla ASA in vitro přidána ke vzorku plné krve a následně byla sledována hodnota agregace. Na počátku bylo potřeba najít množství ASA, které se přidá do 1 ml krve in vitro. Při výpočtu jsme vycházeli z předpokladu, že průměrné množství krve u člověka je 5500 ml. Běžná denní dávka ASA u protidestičkové léčby odpovídá 100 mg ASA. Po převedení 100 mg ASA na 1 ml krve byla přímou úměrou stanovena hodnota 0,0182 mg ASA na 1 ml krve. Tato koncentrace byla převzata z teoretického výpočtu běžné terapeutické dávky za předpokladu 100% utilizace léku. Pro měření bylo naváženo 0,0182 g ASA. Vypočtené množství ASA bylo rozpuštěno v 10 ml roztoku NaCl. Tento roztok byl 100x naředěn roztokem NaCl a do reakce bylo přidáno 100 μl roztoku (do 900 μl krve). Pro monitorování inhibice agregační aktivity přídavkem ASA bylo nejprve potřebné stanovit rychlost inhibiční reakce. Jako vzorek byla použita plná krev 7 zdravých jedinců, která byla smíchána. Množství ASA, které inkubované v 1 ml krve bylo 0,0182 mg ASA. Jednotlivá měření probíhala v časových intervalech po 0, 1, 2 a 5 minutách v duplikátech. Výsledky měření jsou shrnuty v Tab. 6. Z tabulky je patrné, že pro in vitro hodnocení účinku inhibice krevních destiček postačuje čas 2 min. Hodnoty AUC měření dalších časů už nevykazovaly vyšší variabilitu. Zajímavostí je, že pokud přidáme ASA těsně před vlastním měření agregace, tak dochází k viditelné inhibiční reakci (Obr. 10). Pro další analýzu byl vybrán čas 5 minut, který by měl zajistit dostatečnou inhibici destiček.
Obr. 10. Ovlivnění agregace destiček podmíněné časem inkubace ASA v plné krvi 3.1.3Stanovení in vitro inhibiční koncentrace ASAPro in vitro sledování účinku ASA v plné krvi bylo potřebné stanovit koncentrační rozmezí, ve kterém bude možné určit působení ASA na snížení funkce krevních destiček. Stanovená koncentrace ASA 18,2 mg/ml krve, která odpovídá denní dávce 100 mg, byla dále naředěna 1:2, 1:4, 1:8 a 1:16 roztokem NaCl. Z řady měření (Tab. 7) bylo zjištěno, že u vzorků krve zdravých jedinců byla zřetelná změna agregace v závislosti na dávce ASA (Obr. 11). Z obrázku vyplývá, že i poloviční koncentrace ASA, která odpovídá 50 mg ASA, plně postačuje k inhibici funkce krevních destiček. Ve zvoleném koncentračním rozmezí je možné pozorovat pokles agregační schopnosti destiček. Tab. 7. Závislost koncentrace ASA in vitro na snížení agregační schopnosti krevní destičky
Obr. 11. Stanovení in vitro inhibiční koncentrace ASA |