Mestrado em Controlo de Qualidade Área de Especialização em Água e Alimentos

O ovo é uma das fontes nutricionais mais importantes de colina, o corpo humano produz a sua própria colina, mas pode não ser suficiente para suportar as suas necessidades. A colina também possui prováveis benefícios para a função cognitiva. Assim torna-se necessária uma fonte alimentar (Meister et al., 2002).

O ovo fornece uma porção relativamente elevada de nutrientes para indivíduos de todas as faixas etárias, particularmente durante o crescimento, e pode contribuir significativamente para as necessidades diárias individuais em nutrientes essenciais, enquanto fornece uma baixa proporção de calorias. Um ovo de 60g fornece cerca de 367 kJ (90 kcal) (Turnbull, 1998).


1.3 Proteínas com função antimicrobiana

Em contraste com o sistema imunitário dos animais, que produzem polipéptidos antimicrobianos quando necessitam, o ovo resiste eficientemente aos microrganismos, durante longos períodos, na ausência deste sistema de defesa do hospedeiro inato e sistemático.

Aparentemente, o papel principal da clara é manter os microrganismos afastados da gema, o reservatório dos nutrientes do ovo (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000). O albúmen é um meio desfavorável para o crescimento de microrganismos devido: (i) ao elevado pH, alcançando o valor de 9,5 3 a 4 dias após a postura; (ii) ao baixo conteúdo em componentes azotados; (iii) à indisponibilidade de duas vitaminas, a biotina e a riboflavina, através da sua combinação com componentes proteicos; e (iv) à quelatação ávida dos iões férricos (Fe³⁺) pela ovotransferrina (Tranter, 1994).

A maioria das proteínas presentes no albúmen do ovo, possui propriedades antimicrobianas ou outra função biológica interferente com o crescimento e disseminação de microrganismos invasores (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000). Para fazer face à enorme diversidade microbiana existente na natureza, estas proteínas necessitam de possuir funções múltiplas (Naidu, 2000). Estas propriedades são essenciais no desenvolvimento do embrião (Silphaduang et al., 2006).

A lisozima é definida como 1,4-β-N-acetilmuramidase. Esta enzima catalisa a hidrólise da ligação glicosídica entre C₁ do ácido N-acetilmurâmico (NAM) e o C₄ do N-acetilglucosamina (NAG) do peptidoglicano bacteriano (Tranter, 1994, Davis & Reeves, 2002). Esta enzima da clara do ovo demonstra actividade antimicrobiana sobre um espectro limitado de bactérias e fungos (Davis & Reeves, 2002)

A actividade antimicrobiana da lisozima é superior para certas bactérias Gram +, enquanto as bactérias Gram - são menos susceptíveis à acção bacterolítica desta enzima (Tranter, 1994, Davis & Reeves, 2002). Esta diferença de susceptibilidade pode ser explicada pela estrutura em envelope complexa das bactérias Gram -, como a E.coli ou a Salmonella typhimurian, a membrana externa reduz o acesso da lisozima ao seu local activo (Davis & Reeves, 2002).

As paredes celulares do Micrococcus lysodeikticus são as mais sensíveis enquanto que as paredes do Staphilococci são as mais resistentes à acção bactericida desta proteína (Davis & Reeves, 2002). A diferença de sensibilidade à lisozima demonstrada pelas bactérias Gram + pode ser explicada pela presença de proporções superiores de ligações 1,6 ou 1,3 entre NAM e NAG do peptidoglicano, que são mais resistentes à acção da lisozima que as ligações 1,4 (Tranter, 1994).

Entre as bactérias Gram-, Salmonella e Shigella são as mais sensíveis à acção da lisozima, por outro lado as bactérias: E.coli, Vibrio e Proteus são as menos sensíveis a esta enzima (Davis & Reeves, 2002).

A desnaturação térmica da lisozima resulta na perda progressiva da actividade enzimática, mas também no incremento da acção antimicrobiana sobre as bactérias Gram -. A lisozima possui uma acção antibacteriana independente da sua actividade muramidase, esta função deve-se a péptidos bactericidas derivados da proteína, que possuem uma actividade microbicida espantosa e um largo espectro de acção (Abdou et al., 2005). Assim, a actividade antimicrobiana da lisozima deve-se a factores estruturais (Davis & Reeves, 2002).

A ovotransferrina também designada como conalbumina é o componente principal da defesa antimicrobiana do ovo (Tranter, 1994, Ibrahim, 2000).

É a principal proteína de ligação do ferro do ovo. O ferro é um elemento essencial para virtualmente todas as bactérias, pois é necessário para um número elevado de reacções enzimáticas, como grupo prostético ou como co-factor. Várias proteínas e leveduras não crescem em meio nutritivo contendo ovotransferrina (OTf), devido ao sequestro do ferro disponível (Tranter, 1994).

A ovotransferrina age como um agente bactericida e a sua actividade antimicrobiana pode ser desacoplada das suas propriedades de sequestração do ferro, além disso possui um efeito bacteriostáctico (imunidade nutricional) (Naidu, 2000).

A actividade bactericida tem sido atribuída à presença de um péptido (OTAP-92), que é libertado pela quebra específica na sequência Asp-X, reconhecida como o domínio bactericida da molécula OTf (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000, Davis & Reeves, 2002).

O péptido antimicrobiano da ovotransferrina (OTAP-92) é um fragmento catiónico de 92 amino ácidos, localizado entre a sequência 109-200 do domínio N da proteína. Demonstra actividade bactericida sobre as bactérias: S.aureus (Gram +) e estirpes de E.coli (Gram -) (Ibrahim, 2000, Davis & Reeves, 2002). Este péptido catiónico é capaz de eliminar bactérias Gram -, ao atravessar a membrana externa, promover uma via ascendente e danificar a membrana citoplasmática através da formação de um canal (Davis & Reeves, 2002).

Este sistema facilita a transferência de anticorpos específicos do soro da galinha para a gema de ovo e providencia uma fonte de anticorpos (IgY) ao embrião em desenvolvimento.

A gema de ovo pode ser “armada” com uma elevada quantidade de IgY, que podem imobilizar os patogénicos existentes ou em invasão, durante o desenvolvimento do embrião. Assim, a imunização das galinhas poedeiras a vários patogénicos resulta na produção de diferentes antigénios IgY específicos nos ovos. A gema contém 8-20 mg de IgY por ml ou 136-340 mg por gema (Naidu, 2000, Sim et al., 2000).

1.3.4 Avidina

A avidina é uma proteína que se liga até quatro moléculas de biotina com uma afinidade excepcional. É vista como um antibiótico presente na clara de ovo, inibindo o crescimento bacteriano como uma proteína reparadora, na reprodução ou como uma enzima lítica (Mine, 2000).

A avidina inibe o crescimento in vitro de bactérias e leveduras com necessidade de biotina. A sua actividade antimicrobiana pode advir da sua capacidade de ligação a várias bactéria Gram - (E.coli, K. pneumoniae, S. marecescens, P. aeruginosa) e Gram positivas (S. aureus e S. epidermidis). Esta pode agir como um sistema de defesa do hospedeiro com propriedades antimicrobianas e de inibição enzimática (Mine, 2000, Naidu, 2000).

Contudo é necessário mais informação acerca da estrutura tridimensional da avidina para uma compreensão superior do seu papel biológico e da sua função como agente antimicrobiano (Mine, 2000, Naidu, 2000).

Vários estudos demonstram a actividade antimicrobiana da gema de ovo, especificamente atribuída à fracção IgY. Contudo, estudos recentes demonstraram a importância e a actividade antiaderente sobre patogénicos, de outros compostos que não o IgY. Este estudo revelou os grânulos da gema, principalmente as lipoproteínas HDL como os componentes efectivos de protecção contra a colonização e infecção observada por patogénicos entéricos (S. enteritidis, S. typhimurium, E.coli O157:H7) (Kassaify et al., 2005).

A actividade protectora associada à HDL mantém-se intacta após digestão enzimática e possui um efeito antiaderente e não antimicrobiano. O seu efeito anti-infecções ocorre dos seus efeitos negativos directos sobre o metabolismo bacteriano e a modificações nos receptores das células epiteliais necessárias para a adesão e invasão bacteriana (Kassaify et al., 2005).


1.5 Aminas biogénicas – Diaminas e Poliaminas

As poliaminas regulam o crescimento e diferenciação celular nos eucariotas e procariotas. São componentes indispensáveis de todos os organismos vivos, importantes no crescimento, renovação e metabolismo (Sjöholm, 1993, Ha et al., 1998, Medina et al., 2004, Karovičová & Kohajdová, 2005, Soulet & Rivest, 2007). Os estudos respeitantes à composição em aminas são escassos e em geral poucas amostras foram analisadas em cada caso (Tabela 9).

Bardócz et al. (1995) reportam teores de 0,26 a 0,35, 0 a 0,14 e 0,20 a 0,60 mg/kg de putrescina, espermidina, espermina, respectivamente, em ovos cozidos. Okamoto e os seus colegas relatam baixas concentrações de poliaminas nos ovos crus e cozidos. Os teores máximos de aminas encontrados foram 0.4 mg/kg de putrescina, 0,5 mg/kg de cadaverina, 0,5 mg/kg de histamina e 1,4 mg/kg de espermidina (Okamoto et al., 1997, Kalač et al., 2005).

Recentemente, Nishimura e os seus colaboradores analisaram gemas de ovo e referiram a presença de putrescina, espermidina e cadaverina com os seguintes teores, 10, 4 e 261 nmol/g, respectivamente (Nishimura et al., 2006). Outros investigadores identificaram as poliaminas, putrescina, espermidina e espermina nas seguintes concentrações 5, 10 e 5 µg/100 g de ovo (Larqué et al., 2007).


2- Modificações na composição do Ovo durante o armazenamento

2.1 Conservação

O período para o consumo de ovos frescos tem sido definido como três semanas, no entanto, o período de tempo e temperatura máximos de armazenamento para ovos em temperatura ambiente e sob refrigeração são motivos de debate permanente (Cepero et al., 1995).

O congelamento do ovo inteiro líquido é um método comum de preservação. A pasteurização anterior ao congelamento provoca uma modificação no comportamento de difusão durante o armazenamento. A viscosidade aparente aumenta com a pasteurização e com o armazenamento em gelo (Szczesniak, 1998).

O uso de atmosferas controladas (ar ou azoto com 45% de CO₂) é uma forma eficaz para preservar os ovos. O armazenamento refrigerado preserva os ovos durante 6-9 meses, sendo que o prazo de prateleira aumenta quando são armazenados a -1,5 ºC. A perda de peso do ovo durante o armazenamento varia entre 3,0-6,5 % (Belitz & Grosh, 1987). Outra alternativa é a redução da porosidade da casca embebendo-a em óleo, ou aquecimento breve em água de forma a coagular a camada proteica da casca, ou o uso de embalagens impermeáveis (Linden & Lorient, 1999).

O conteúdo do ovo de galinha pode ser contaminado, prévia (transmissão horizontal) ou posteriormente à postura (transmissão vertical). No último caso, a clara é contaminada quando a cutícula, a casca e as membranas da casca falham na prevenção da invasão microbiana. Na clara os microrganismos encontram outros obstáculos, resultantes das proteínas antimicrobianas existentes, do pH alcalino e da temperatura (Messens et al., 2004).

Após lavagem da casca com A – Extran e B – Tergitol

A casca dos ovos pode ser um veículo de microrganismos patogénicos para o Homem, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e a Yersinia enterocolítica são alguns microrganismos encontrados na casca. A casca pode ser contaminada, com matéria fecal no local de postura, com a água de lavagem, durante a manipulação e durante o armazenamento (Favier et al., 2000).

Um dos processos utilizados para diminuir a contaminação dos ovos é a lavagem da casca. Contudo o efeito dos agentes físicos e químicos usados durante a lavagem constitui um ponto essencial na redução ou eliminação do risco de contaminação da casca. Alguns destes produtos podem alterar a cutícula, fina e delicada, da casca e permitir a re-contaminação futura do ovo. Num estudo realizado por Favier et al., com os detergentes Extran e Tergitol, verificou-se a sua eficácia na eliminação de bactérias à superfície e também que estes detergentes provocam várias alterações na casca e afectam a estrutura da camada interna, Fig 3. Isto pode favorecer a penetração das bactérias após lavagem e produzir modificações bioquímicas no conteúdo do ovo (Favier et al., 2000).

2.2.1 Salmonella spp.

A Salmonella spp. é o principal contaminante do ovo, pode ser encontrada na casca de ovo e também pode estar presente dentro do ovo como resultado de transmissão transversal durante a sua formação. Números superiores de S. enteritidis são encontrados mais frequentemente na clara do que na gema (Smith et al., 2003). Os ovos ou os seus produtos são dos principais responsáveis pelos surtos alimentares causados por esta bactéria, por outro lado uma das origens mais frequentes de surtos alimentares é a presença desta bactéria e da sua enterotoxina.

A pasteurização destrói efectivamente a S. enteritidis enquanto mantém as suas propriedades funcionais, mas o uso contínuo de ovos em casca não pasteurizados em bolos domésticos aumenta o risco de contaminação dos produtos de pastelaria pela Salmonella spp. . Muitos produtos de pastelaria à base de ovo assentam num tratamento térmico mínimo para produzir um produto mais leve e macio. Estes produtos, especialmente quando são preparados com ovos não pasteurizados são causas frequentes de surtos (Radkowski, 2001, Smith et al., 2003). A pasteurização de ovos é critica no controlo de surtos de doenças alimentares causadas por Salmonella. Os ovos pasteurizados devem ser usados em produtos não ou ligeiramente cozinhados ou em produtos que requerem a associação ou conservação da casca do ovo. Deve-se ainda evitar o uso de ovos fendidos (Smith et al., 2003).

É necessário reduzir o risco para a saúde pública associado ao consumo de ovos infectados com S. enteritidis. A vacinação das galinhas pode ser uma forma efectiva de reduzir tal contaminação. De facto, Buck e os seus colaboradores demonstraram que a imunização de galinhas poedeiras com fímbrias do tipo1 reduz substancialmente o número de ovos contaminados e reduz a colonização do sistema reprodutivo da galinha (Buck et al., 2005).

A frescura, a característica mais relacionada com a qualidade do ovo, declina após a postura dependendo do tempo e temperatura. Este declínio na qualidade é associado às modificações químicas, nutricionais, funcionais e higiénicas (Hidalgo et al., 2006).

Aspecto dos ovos frescos e dos ovos envelhecidos (baseado em Larrañaga

Uma série de modificações ocorrem durante o armazenamento do ovo. A difusão de CO₂ através dos poros da casca, que começa logo após a postura, provoca um aumento no pH, especialmente na clara do ovo. A evaporação de água gradual através da casca provoca a diminuição da densidade (inicialmente com o valor de 1,086; o coeficiente de redução diário é aproximadamente de 0,0017 g/cm³) e a câmara de ar alarga. Verifica-se igualmente aumento do peso da gema e diminuição da densidade, do peso do ovo e do peso do albúmen (Silversides & Villeneuve, 1994, Silversides & Scott, 2001, Silversides & Budgell, 2004, Jones, 2007).

Ocorre conversão da ovalbumina em S-ovalbumina e sucede a dissociação do complexo ovomucina-lisozima (com a destruição do gel de ovomucina), que resulta na diminuição da viscosidade da clara do ovo e na consequente redução das suas propriedades gelificantes e espumantes, ver Figura 4 (Davis & Reeves, 2002). A gema de ovo é compacta e vertical, mas achata durante o armazenamento, ver Figura 4. Além disso a membrana vitelina da gema torna-se rígida e quebra quando o ovo é aberto e desenvolve-se um aroma a “mofo” (Belitz & Grosh, 1987, Szczesniak, 1998).

Estas alterações são usadas para determinar a idade de um ovo, por exemplo o teste de flutuação (alteração da densidade do ovo), a iluminação (posição e forma da gema), o teste da viscosidade da clara, a medição da dimensão da câmara de ar, o índex refractivo e ensaios sensoriais para detectar o aroma a “mofo” (realizados com ovos levemente fervidos) (Belitz & Grosh, 1987, Hidalgo et al., 2006).

Recentemente, Hidalgo et al, propuseram um teste baseado na furosina [e-N-(2-furoilmetil-L-lisina) ] para avaliar a frescura dos ovos em casca., no qual é detectada a furosina presente no albúmen. Este teste mostra elevada reprodutibilidade e baixa variabilidade natural em ovos frescos e é independente do peso do ovo, idade da galinha e da humidade relativa de armazenamento (Hidalgo et al, 2006).

A perda da qualidade dos ovos, assim como a perda de CO₂ e de água durante o armazenamento, são menores para uma temperatura de armazenamento inferior. Assim o armazenamento refrigerado é importante para a preservação do ovo, as condições vulgarmente usadas são: temperatura entre os 0 a -1,5 ºC e humidade relativa de 85-90% (Belitz & Grosh, 1987).

O conteúdo do albúmen e o conteúdo total de proteínas pode variar significativamente com a idade da galinha. Os ovos armazenados, por grandes períodos, a 2ºC mostram uma redução significativa no conteúdo em treonina, este amino ácido pode ser também reduzido durante a cozedura do ovo (Turnbull, 1998). Os lípidos de um ovo fresco encontram-se todos na gema, no entanto, pode ocorrer migração para o albúmen em ovos não frescos (Stadelman et al., 2003).

A modificação de várias propriedades do ovo, como o comportamento e estabilidade da clara de ovo é um factor importante para o processamento do ovo (Belitz & Grosh, 1987).

Os ovos estão na base de um extraordinário número de usos, um facto enfatizado pela quantidade de produtos alimentares e não alimentares que contém ovos ou os seus produtos. A popularidade do ovo deve-se às suas características únicas e variadas.

Os ovos e os seus produtos são usados na indústria alimentar pelo seu valor nutricional, mas também devido às suas propriedades funcionais, nomeadamente, coagulante, emulsionante, aromatizante e corante, que os tornam indispensáveis em processos de produção (Linden & Lorient, 1999). As propriedades funcionais do ovo têm sido usadas por cozinheiros, chefes e pela indústria alimentar. A sua disponibilidade, assim como o seu preço têm sido factores importantes na sua aplicação.

Os ovoprodutos são amplamente utilizados na indústria alimentar, contudo apresentam alguns factores limitativos, ver Tabela 10. É de realçar que os produtos do ovo têm um custo elevado em relação a outros ligantes protéicos (proteínas de leite, sangue ou soja), mas as excelentes propriedades, espumante e coagulante da clara e emulsionante da gema justificam a sua aplicação (Souza-Soares & Siewerdt, 2005).

A coagulação é uma mudança na estrutura das proteínas do ovo que resulta na sua perda de solubilidade e espessamento. Pode ser provocada por calor, meios mecânicos, sais, ácidos ou bases. O ovo move-se de um estado fluído para um estado sólido designado coágulo. A coagulação térmica acontece a partir dos 62 ºC para a clara e desde os 65 ºC no caso da gema (Mine, 1995, Kiosseoglou & Paraskevopoulou, 2005). A exposição a temperaturas superiores resulta em níveis superiores de floculação e em géis mais resistentes. Contudo a partir dos 90 ºC ou de tempos de aquecimento exagerados pode ocorrer diminuição da resistência do gel, contracção do gel e sinerese (Mine, 1995, Aguilera & Rademacher, 2004). As ovoalbumina e a conalbumina possuem boas propriedades gelificantes. Dentre as proteínas da clara, apenas a ovomucoide não coagula. As proteínas da gema estão igualmente sujeitas à termocoagulação, com excepção das livetinas e da fosvitina (Belitz & Grosh, 1987, Linden & Lorient, 1999).

O sal e o açúcar protegem contra a desnaturação térmica e permitem aumentar a temperatura de pasteurização em 6 e 3 ºC, respectivamente. Esta protecção ocorre devido à redução da água livre na fase solúvel. A modificação da estrutura da proteína ligada à água melhora a estabilidade da mistura e atrasa a desnaturação (Linden & Lorient, 1999).

O sucesso de muitos alimentos cozinhados depende da coagulação das proteínas do ovo. A clara e a gema do ovo podem ser utilizadas devido à sua capacidade de se ligarem em conjunto a alimentos.

A gema de ovo é uma dispersão de gotículas de óleo em água – uma emulsão. Todos os constituintes do ovo, lipoproteínas LDL e HDL, fosvitina e livetina possuem a capacidade de adsorver na interface óleo-aquosa (Anton et al., 2001).

A capacidade emulsionante é atribuída principalmente às lipoproteínas LDL e aos fosfolípidos (Linden & Lorient, 1999, Anton et al., 2001, Anton et al., 2003).

A viscosidade da gema do ovo confere boa estabilidade às emulsões, existe uma relação linear entre a estabilidade da emulsão e a raiz quadrada da viscosidade. A adição da clara à gema de ovo diminui a estabilidade das emulsões formadas e este efeito está ligado essencialmente a um decréscimo na viscosidade (Linden & Lorient, 1999).

A viscosidade da gema aumenta com a adição de cloreto de sódio, o que melhora a estabilidade das emulsões pois provoca uma importante diminuição da capacidade emulsionante dos constituintes da gema. O sal provoca uma desidratação dos complexos protéicos e lipoprotéicos da gema, pois o sódio utiliza uma parte de água para sua dissolução. Assim, as proteínas desidratadas tendem a associar-se, resultando no aumento da viscosidade (Linden & Lorient, 1999).

É de referir, que a pasteurização, o congelamento e a concentração têm pouco impacto nas propriedades emulsionantes da gema (Anton et al, 2001, Anton et al, 2003).

Quando a clara de ovo é batida, ocorre o aprisionamento de bolhas de ar no albúmen e é formada uma espuma – fase gasosa dispersa numa fase líquida. Devido à elevada área superficial na interface líquida/gasosa, as proteínas desnaturam e agregam-se durante o processo de bater a clara (Belitz & Grosh, 1987). A clara é especialmente sensível ao batimento excessivo, bater a clara durante mais de 6-8 minutos causa a agregação - coagulação parcial das proteínas na interface ar-água. Estas proteínas, que não podem ser dissolvidas, não estão adsorvidas propriamente na interface e não formam um filme interfacial coerente, uma vez que a viscosidade da lamela líquida não é a suficiente para criar uma boa estabilidade da espuma (Linden & Lorient, 1999).

A capacidade agregante assim como a estabilidade são critérios importantes para as propriedades espumantes. A clara de ovo é um excelente agente espumante (Mine, 1995). Esta propriedade é muito usada no fabrico de produtos alimentares mais leves, por exemplo soufflé, omoletes (Belitz & Grosh, 1987, Davis & Reeves, 2002).


3.4 Capacidade aromática e corante

O ovo inteiro, particularmente a gema, possui um aroma característico e muito apreciado. A gema fresca tem um odor suave mas desenvolve um aroma agradável característico durante o aquecimento. O odor e propriedades aromáticas da gema crua e cozida podem ser influenciados pela fonte de proteínas na dieta da galinha (Maga, 1982).

Nenhum componente isolado dos ovos pode ser considerado o responsável pelo seu sabor característico. O sabor de ovos tem sido descrito como fresco, leve, doce, terroso, e bolorento. Os ovos são usualmente adicionados em produtos de pastelaria, mas também são apreciados por eles próprios devido ao seu aroma distinto (Ensminger et al., 1995).

Os aromas estão ligados aos lípidos da gema que contêm centenas de compostos voláteis (Linden & Lorient, 1999). A oxidação dos lípidos e as reacções de Maillard são as vias mais importantes na formação dos aromatizantes da gema de ovo.

Umano e os seus colaboradores identificaram 85 compostos voláteis no ovo inteiro, 75 na gema de ovo e 57 na clara de ovo. De acordo com eles o ovo inteiro possui como componentes principais nitrilos, alquibenzenos, cetonas, pirazinas, pirróis e piridinas. O ovo cozido contém elevadas quantidade de cetonas, pirazinas e nitrilos (Umano et al., 1990). Vários estudos compararam os voláteis totais da gema de ovo e os voláteis totais produzidos pelo ovo inteiro e verificaram que a gema produz menos cetonas, índoles e mais pirazinas (Adamiec et al., 2002).

Cerny e Guntz centraram-se na verificação dos compostos que contribuem efectivamente para o aroma da gema ovo, a Tabela 11 apresenta os compostos identificados como poderosos aromatizantes (Cerny & Guntz, 2004).

Os pigmentos presentes na gema – xantofilas, luteína e zeaxantina- fornecem cor à gema. A cor da gema depende da quantidade de xantofilas e carotenóides, que provêm da dieta do animal. Esta determina a atracção e aceitabilidade do ovo ou dos produtos contendo ovo para o consumidor. Por exemplo, pigmentos do ovo contribuem para a cor amarela desejável para produtos de pastelaria, omoletes, etc. Contudo, é raro o uso dos ovos como ingredientes em produtos alimentares apenas pelo seu contributo para a cor (Linden & Lorient, 1999).

Após revisão da literatura referente à composição, modificações ao longo do armazenamento e propriedades funcionais do ovo, verificou-se que um dos aspectos menos estudados da gema era a composição em aminas biogénicas e da fracção volátil. Deste modo, foram delineados os seguintes objectivos para este trabalho:

1. 
   Optimizar uma metodologia de HPLC para separação e quantificação de aminas biogénicas em gema de ovo;
   
2. 
   Caracterizar a gema proveniente de ovos caseiros e comerciais, no que respeita aos teores de aminas biogénicas;
   
3. 
   Avaliar a influência de diferentes temperaturas de armazenamento dos ovos (5 ± 1 ºC e 25 ± 1 ºC) na composição em aminas biogénicas da gema ao longo do prazo de validade.
   

1. 
   Optimizar um método HS-SPME para a extracção dos compostos voláteis;
   
2. 
   Identificar os compostos voláteis presentes em cremes de pasteleiro contendo gema de ovo e substitutos;
   
3. 
   Prever a origem dos cremes de pasteleiro recorrendo à análise discriminante com base nos diferentes perfil voláteis dos cremes de pasteleiro;
   
4. 
   Caracterizar o perfil sensorial dos diferentes cremes de pasteleiro;
   
5. 
   Comparar o perfil volátil com o perfil sensorial dos diversos cremes de pasteleiro.
   

As aminas biogénicas e em particular as poliaminas estão presentes em baixas concentrações nas células dos procariotas e eucariotas e desempenham funções reguladoras no crescimento. São formadas e degradadas durante o metabolismo normal dos animais, plantas e microrganismos (Saito et al., 1992; Stute et al., 2002, Leitão et al., 2005, Lavizzari et al., 2006, Innocente et al., 2007).

As aminas exercem funções fisiológicas importantes nos tecidos animais e vegetais (Soulet & Rivest, 2007). São fontes de azoto e são precursores da síntese de hormonas, alcalóides, ácidos nucléicos e proteínas. São importantes substâncias mensageiras e regulam o funcionamento celular (Brink et al., 1990, Medina et al., 2003, Chiacchierini et al., 2006). Nas plantas e nos animais, as poliaminas estão envolvidas em vários processos celulares como a divisão e diferenciação celular, regulação da expressão dos genes (através da alteração da estrutura do DNA e modulando as cinases proteícas e os factores de transcrição), a síntese de ácidos nucléicos e proteínas, manutenção da estabilidade membranar e dos ácidos nucléicos e nas repostas ao stress (Sousadias & Smith, 1995, Ha et al., 1998, Wada et al, 2002, Moret et al., 2005, Soda et al., 2005, Soulet & Rivest, 2007). Devido à diversidade dos seus papéis no metabolismo celular e no crescimento, são requeridas em elevados níveis nos tecidos em rápido crescimento (Karovičová & Kohajdová, 2005).

Todas as células possuem a capacidade de produzir poliaminas, contudo durante o crescimento e o envelhecimento celular o seu conteúdo em poliaminas diminui (Santos, 1996, Nishimura et al., 2006).

As aminas podem ser classificadas em função do número de grupos amina, da estrutura química e da via sintética. Quanto ao número de grupos amina na molécula classificam-se em monoaminas (tiramina, feniletilamina), diaminas (histamina, triptamina, serotonina, putrescina e cadaverina) e poliaminas (espermina, espermidina e agmatina) (Bardócz, 1995, Kalač et al., 2005, Smith et al., 2000, Larqué et al., 2007).

Relativamente à sua estrutura química, podem ser alifáticas (putrescina, cadaverina, espermina e espermidina), aromáticas (tiramina e feniletilamina) ou heterociclícas (histamina e triptamina) (Medina et al., 2003, Kalač & Krausová, 2005, Kvasnicka & Voldrich, 2006).).

A espermina e espermidina são formadas in situ nas células à medida que são requeridas, com a agmatina e a putrescina como intermediárias (Bardócz, 1995, Ruiz-Capillas & Jiménez-Colmenero, 2004).

As aminas biogénicas derivam essencialmente da descarboxilação dos aminoácidos do respectivo precursor, através de enzimas substrato específicas resultantes de microrganismos, ou alternativamente devido à aminação e transaminação de aldeídos e cetonas (Friday & Firman, 1999, Kvasnicka & Voldrich, 2006, Punakivi et al., 2006). A descarboxilação dos amino ácidos ocorre pela remoção do grupo α-carboxil formando a amina correspondente (Shalaby, 1996).

As diaminas, triptamina, putrescina e cadaverina são formadas, como se observa na Figura 5, a partir da histidina, tirosina, fenilalanina, triptofano, ornitina e lisina, respectivamente (Mariné-Font et al., 1995; Punakivi et al., 2006).

A biossíntese das poliaminas é controlada por duas enzimas, ornitina descarboxilase (ODC) e S-adenosimetionina descarboxilase (AdoMetDC) e as poliaminas são formadas a partir da metionina e da ornitina (Fig. 5) . A metionina fornece o grupo aminopropil necessário à conversão de putrescina nas poliaminas mais complexas. A síntese é realizada através de duas enzimas aminopropiltransferases, espermina e espemidina sintetase. As plantas e os microrganismos também podem produzir putrescina através da actividade da arginina descarboxilase (ADC) (Kalač & Krausová, 2005, Cipolla et al., 2007).

As aminas estão presentes numa larga variedade de produtos alimentares como o chocolate, bolachas de água e sal, peixe e produtos do peixe, cerveja, vinho tinto, queijo, etc. (Arce et al., 1998, Bodmer et al., 1999, Soleas et al., 1999, Lange & Wittmann, 2002, Kvasnička & Voldřich, 2006, Önal, 2007). São formadas em processos metabólicos ou através de actividade microbiana (Smith et al., 2000, Kvasnička & Voldřich , 2006)

Os pré-requisitos para a formação de elevadas quantidades de aminas biogénicas nos alimentos são a existência de aminoácidos livres, a presença de microrganismos descarboxilase-positivos e condições favoráveis ao crescimento bacteriano e à actividade microbiana (Lange & Wittmann, 2002, Innocente et al., 2007). As aminas podem ser constituintes naturais de alguns alimentos: por exemplo a tiramina e a serotonina estão presentes em alguns vegetais e frutos; e a putrescina, igualmente relacionada com a degradação dos alimentos, também se pode encontrar em alguns vegetais e frutos. No decorrer da deterioração dos alimentos é usual observar-se um aumento da concentração de aminas biogénicas (Wada et al., 2002, Ferreira & Pinho, 2006, Önal, 2007).

A.1.2. Metodologias analíticas para doseamento de aminas biogénicas

A determinação das aminas biogénicas em alimentos é geralmente realizada através de métodos cromatográficos incluindo: cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia gasosa, electroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alta eficiência. As aminas biogénicas podem ainda ser detectadas recorrendo a métodos bioquímicos de análise, como sendo, testes imunológicos de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbente Assay) e testes realizados com culturas bacterianas descarboxilase-oxidativas em tirosina-agar. Os testes imunoenzimáticos para a histamina são realizados recorrendo a Kits comerciais que apresentam elevada reprodutibilidade, originam poucos “falsos negativos” e “falsos positivos” quando comparados com o método fluorimétrico oficial AOAC (AOAC, 1995).

A aplicação directa de um único procedimento cromatográfico não é fiável para a determinação simultânea das aminas devido à ausência de um cromofóro ou fluróforo comum na sua estrutura (Paleólogos et al., 2003). Torna-se necessário realizar uma derivatização pré ou pós-coluna, introduzindo um grupo facilmente detectado no grupo amina, para aumentar a sensibilidade do método analítico (Casal et al., 2002, Loukou & Zotou, 2003, Önal, 2007).

Na literatura estão descritos vários agentes derivatizantes, sendo de destacar, o cloreto de dansilo (Carlucci & Karmas, 1988, Romero et al., 2001, Chiacchierini et al., 2006, Soufleros et al., 2007), cloreto de dabsilo (Krause et al., 1995, Romero et al., 2001), a ninidrina (Joosten & Olieman, 1986) a iodoplatina, a fluorescaína (Kalligas et al., 1994) e o oftaldeído (OPA) (Veciana-Nogues et al., 1995, Romero et al., 2001).

Os métodos analíticos para a análise de aminas, geralmente, envolvem 3 passos principais: extracção da aminas, purificação do extracto e derivatização. O método mais usado na determinação de várias aminas é o HPLC (Ferreira & Pinho, 2006).

Diferentes solventes são usados na extracção de aminas, nomeadamente, os ácidos hidroclorídico, tricloroacético, perclórico, assim como, metanol e outros solventes orgânicos. A extracção das aminas representa um passo crítico do processo e pode influenciar negativamente as recuperações analíticas (Vinci & Antonelli, 2002).

Na detecção de aminas biogénicas por HPLC utiliza-se geralmente um detector de UV ou de fluorescência, após derivatização (Loukou & Zoutou, 2003 b, Ferreira & Pinho, 2006). O reagente de derivatização mais usado é o cloreto de dansilo (Casal et al., 2002, Chiacchierini et al., 2006, Önal, 2007, Soufleros et al., 2007) contudo o cloreto de dabsilo apresenta algumas vantagens importantes. O cloreto de dabsilo é um reagente excelente na detecção espectofotométrica visto formar compostos com cor que podem ser detectados na zona do visível (λ = 436-460 nm) com elevada especificidade e sensibilidade e os derivados das aminas primárias e secundárias são estáveis à temperatura ambiente (Krause et al., 1995, Romero et al., 2000, Castillo & Castells, 2001, Loukou & Zotou, 2003).

As colunas cromatográficas mais utilizadas na separação das aminas biogénicas por HPLC são as de troca iónica e as de fase reversa, podendo a derivatização efectuar-se pré ou pós-coluna. O último caso é mais reprodutível, contudo o equipamento requerido é muito dispendioso, o que limita a sua utilização. Por outro lado, a derivitazição pré-coluna obriga a um trabalho cuidadoso ao nível de controlo de tempos e temperaturas de reacção, de modo a garantir a estabilidade e reprodutibilidade dos derivados formados (Ferreira & Pinho, 2006).

A cromatografia gasosa tem surgido como alternativa ao HPLC. A alta resolução das colunas capilares utilizadas, juntamente com um sistema selectivo de detecção, tem possibilitado a análise por GC com muita eficácia. Porém, a cromatografia gasosa apresenta alguns problemas relacionados com a baixa massa molar, a elevada solubilidade na água e a baixa volatilidade destes compostos (Kataoka, 1996). Assim sendo, é necessário recorrer a reacções de derivatização de forma a reduzir a polaridade aumentando a volatilidade. Reacções como a acilação, sililação, dinitrofenilação e formação de produtos de condensação são os procedimentos mais difundidos de derivatização de aminas primárias, secundárias, terciárias, insaturadas e aromáticas (Kataoka, 1996). A detecção pode ser feita por FID (detector por ionização em chama) ou por MS (Espectrometria de massa).

A.2. Parte experimental

A.2.1 Amostragem

No presente estudo foram usados ovos, caseiros e comerciais, de tamanho médio, com peso entre 53-62 g. Após postura dos ovos caseiros estes foram armazenados a duas temperaturas diferentes, nomeadamente, a 25±1º C e a 5±1º C. Posteriormente foram analisados (em duplicado) após 1, 4, 8, 12, 16 e 20 dias de armazenamento, como se pode observar na Fig.6.

Adicionalmente, usaram-se ovos comerciais de cinco marcas, disponíveis no mercado. Estes estavam no estabelecimento comercial à temperatura ambiente e foram adquiridos entre 2 a 3 dias após a postura. No laboratório foram armazenados a duas temperaturas diferentes, 25±1ºC e 5±1ºC. Foram analisados (em duplicado), periodicamente (3, 8, 10, 13, 17, 23 e 26 dias), até atingirem a data indicada no prazo de validade (Fig. 7).

As soluções padrão foram preparadas numa concentração de 4 g/L. Usou-se ácido clorídrico 0,1 M para este propósito.

Ácido tricloroacético 5 % prepara-se dissolvendo 12,5 g de ácido concentrado em 100 ml de água ultra-pura.

BEHPA/clorofórmio 0,1 M consiste numa mistura de 8,61 ml de BEHPA concentrado e clorofórmio até perfazer o volume final de 250 ml.

Tampão fostato 0,2 M consiste em 9,13 g de hidrogeno fosfato de potássio trihidratado dissolvidos em água ultra-pura até perfazer 200 ml

Tampão reacção (0,15 mol/l NaHCO_3, pH 8,6) consiste em 630 mg de hidrogeno carbonato de sódio dissolvidos em 40 ml desionizada, ajusta-se o pH a 8,6 com NaOH diluída e perfez-se o volume de 50 ml com água ultra-pura.

Tampão diluição é uma mistura de 50 ml de acetonitrilo, 25 ml de etanol e 25 ml de tampão eluição A.

Reagente cloreto de dabsilo (6,2 mM em acetona), prepara-se dissolvendo 20 mg de cloreto de dabsilo em 10 ml de acetona pela acção de ultrassons (10 min), filtra-se e armazena-se a -20 ºC.

Incubam-se as amostras a 70ºC durante 15 min, com agitação ao 1º min e 12º min. Colocam-se as amostras ou padrões em gelo durante 10 min de modo a parar a reacção. Após centrifugação (5 min, 13 000 g), os sobrenadantes límpidos são directamente injectados ou armazenam-se a -20ºC até à cromatografia. A Fig. 8 apresenta o esquema da extracção das aminas presentes nas amostras e subsequente derivatização.

Os dados foram adquiridos e analisados usando o programa Borwin Controller Software (JMBS, França).

As aminas derivadas do dabsilo são separadas por uma coluna C18 I.D. Spherisorb ODS, 150 x 4,6 mm, 3 μm.

A fase móvel A consiste em 9mM de dihidrogenofosfato, 4% dimetilformamida e 0,1-0,2 % de trietilamina (TEA), com pH 6,55 por meio de ácido fosfórico. A fase móvel B é uma mistura de 80% (v/v) de acetonitrilo aquoso.

As aminas dabsiladas são eluídas com um fluxo de 1 ml/minuto usando o gradiente exposto na Tabela 12, a detecção foi realizada a 436 nm.

Tabela 12. Esquema do gradiente de eluição usado na separação das aminas biogénicas em estudo.