Nutricionizam Kristina Greblo 5276/n antioksidativno I antimikrobno djelovanje eteričnog ulja I ekstrakata lavande završni rad modul

3. EKSPERIMENTALNI DIO

3.1. MATERIJALI

U istraživanju je korištena suha lavanda i eterična ulja lavande sa četiri područja Republike Hrvatske: Vižinada, Fužine, Hvar, Donja Bistra. Uzorci s područja Istre pripadaju vrsti budrovki, ubranih početkom srpnja 2008. godine, uzorci s Hvara su obična lavanda (hibridna) i budrovka, iz berbe 2008. s nasada starih tri godine. Vrsta lavande uzgajana na području Fužina je Lavandula angustifolia. Berba ovih uzoraka provedena je tijekom druge polovice srpnja, 2008. godine a nasadi su stari dvije godine. U Donjoj Bistri uzgaja se lavandin, vrijeme berbe je srpanj, 2008 godine. Lavanda sa svih područja sušena je na tradicionalan način, u prozračnim prostorijama, na propuhu, buketićima obješenim prema dolje. Eterična ulja sa svih područja dobivena su destilacijom vodenom parom.

3.2. METODE RADA

Tijekom istraživanja u ekstraktu sušene lavande određivani su:

• 
  Ukupni fenoli
  
• 
  Ukupni flavonoidi
  
• 
  Antioksidacijski kapacitet (DPPH i FRAP metodom)
  
• 
  Antimirobna aktivnost (ekstrakata i eteričnih ulja lavande)
  

3.2.1. Ekstrakcija fenolnih spojeva

Ekstrakcija fenolnih spojeva provedena je pomoću dvaju otapala: 30%-tna vodena otopina etanola, 30%-tna vodena otopina acetona, uz refluks u vodenoj kupelji pri temperaturi 60°C te u trajanju 30 minuta.

Odvaže se 1g uzorka s točnošću 0,1 g u Erlenmeyerovu tikvicu s ubrušenim grlom, volumena 100 ml, zatim se doda 40 ml 30% etanola (ili 30 % acetona) te ručno homogenizira. Stavi se u vodenu kupelj na 60ºC uz refluks, 60 minuta. Nakon provedene ekstrakcije sadržaj se profiltrira u odmjernu tikvicu volumena 50 ml i nadopuni otapalom korištenim za ekstrakciju do oznake. Dobiveni ekstrakti koriste se za određivanje ukupnih fenola, flavonoida i antioksidacijskog kapaciteta. Na istom uzorku provedena su dva paralelna mjerenja. Ekstrakti su čuvani pri 4 ^oC do analize.

1. 
   staklene boce volumena 1l,
   
2. 
   menzura volumena 500 ml,
   
3. 
   analitička vaga (METTLER),
   
4. 
   vodena kupelj, zagrijana na 60^oC
   
5. 
   pipete, volumena 5 ml, 10ml, 20 ml,
   
6. 
   staklena čaša.
   

1. 
   96%-tni etanol,
   
2. 
   30 %-tna vodena otopina etanola,
   
3. 
   100%-tni aceton,
   
4. 
   30 %-tna vodena otopina acetona,
   
5. 
   destilirana voda.
   

3.2.2. Određivanje ukupnih fenola i flavonoida

1. 
   Erlenmeyerove tikvice, volumena 50 ml,
   
2. 
   Erlenmeyerove tikvice s ubrušenim grlom, volumena 50 ml
   
3. 
   analitička vaga (METTLER),
   
4. 
   filter papir,
   
5. 
   lijevak.
   
6. 
   kivete,
   
7. 
   spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ),
   
8. 
   automatska pipeta, volumena 1000ml.
   

1. 
   30%-tna vodena otopina etanola,
   
2. 
   30%-tna vodena otopina acetona,
   
3. 
   Folin – Ciocalteu reagens,
   
4. 
   zasićena otopina natrijeva karbonata (m/v), Na₂CO₃,
   

U Erlenmayerovu tikvicu, volumena 25 ml, otpipetira se 0,25 ml uzorka, 15 ml destilirane vode, 1,25 ml Folin – Ciocalteu reagensa (potrebno ga je razrijedit neposredno prije mjerenja u omjeru 1:2). Nakon 3 minute, doda se smjesi 3,75 ml zasićene otopine natrijeva karbonata te otapalom korištenim za ekstrakciju nadopuni do oznake.

U slijepu probu, umijesto uzorka dodaje se isti volumen destilirane vode.

Nakon toga, tikvice se termostatiraju u vodenoj kupelji na 50ºC, 30 minuta te izmjeri apsorbancija pri valnoj duljini od 760nm.

Iz pripremljene otopine galne kiseline rade se razrjeđenja, u odmjernim tikvicama volumena 100 mL, tako da koncentracije galne kiseline iznose: 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/L.

Razrjeđenja se prirede tako što se u odmjerne tikvice volumena 100 mL redom doda: 0, 1, 2, 3, 5 i 10 mL otopine galne kiseline i nadopuni destiliranom vodom do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 0,5 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 50 mL te se postupa po propisu za određivanje ukupnih fenola.

Baždarni pravac se nacrta pomoću računala pri čemu se na apscisu nanesu koncentracije galne kiseline (mg/L), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 765 nm.

Račun:

Koncentracija ukupnih fenola izračuna se prema jednadžbi pravca koja se dobije pomoću programa Excel.

U ovom radu izračunata jednadžba pravca glasi:

y = 0,0009 x

R² = 0,99

gdje je: y – apsorbancija pri 765 nm

x – koncentracija galne kiseline (mg/L)

R² – koeficijent determinacije

1. 
   automatska pipeta,
   
2. 
   pipete, volumena 1 ml, 2 ml, 10 ml, 25 ml,
   
3. 
   čaša, volumena 50 ml,
   
4. 
   analitička vaga (METTLER),
   
5. 
   kivete,
   
6. 
   vorteks,
   
7. 
   centrifuga,
   
8. 
   epruvete,
   

1. 
   otopina natrijeva nitrita (1:20), NaNO_2,
   

2. 
   otopina aluminijeva klorida (1:10) (m/v), AlCl₃,
   

3. 
   1 M otopina natrijeva hidroksida, NaOH,
   
4. 
   30 %-tna vodena otopina etanola (v/v)
   

U kivete se otpipetira 0,5 ml uzorka, 2 ml destilirane vode, 0,15 ml otopine natrijeva nitrita (1:20), pričeka se 5 minuta te doda 1,5 ml otopine aluminijeva klorida (1:10), ponovo pričeka 6 minuta te doda 1M NaOH, nakon čega nastaje mliječno bijelo zamućenje. Smjesa u kiveti dobro se promiješa pomoću vorteksa te stavi na centrifugiranje pri 10000 o/min tijekom 10 minuta. Dobiveni supernatant odekantira se u epruvete te izmjeri apsorbancija pri valnoj duljini od 450 nm prema slijepoj probi koja sadrži sve kemikalije osim uzorka.

Iz pripremljene otopine rutina rade se razrjeđenja, u odmjernim tikvicama volumena 5 mL, tako da koncentracije rutina iznose: 50, 100, 150, 200 i 250 mg/100 mL.

Razrjeđenja se prirede tako što se u odmjerne tikvice volumena 5 mL redom doda: 1, 2, 3, 4 i 5 mL otopine rutina i nadopuni 30 %-tnom vodenom otopinom etanola do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 1 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 10 mL te se postupa po propisu za određivanje flavonoida.

Baždarni pravac se nacrta pomoću računala pri čemu se na apscisu nanesu koncentracije rutina (mg/100 mL), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 510 nm.

Račun:

Koncentracija flavonoida izračuna se prema jednadžbi pravca koja se dobije pomoću programa Excel.

U ovom radu izračunata jednadžba pravca glasi:

y = 0,0029 x

R² = 0,99

gdje je:

x – koncentracija rutina (mg/100 mL)

R² – koeficijent determinacije

3.2.3. Određivanje antioksidacijskog kapaciteta

3.2.3.1. DPPH (2,2-difenil-pikrilhidrazi) metoda

Za određivanje antioksidacijskog kapaciteta određenog spoja ili ekstrakta iz prirodnog izvora DPPH-metodom, prati se reakcija između stabilnog radikala 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila (DPPH•), i uzorka u kojem se mjeri antioksidacijska aktivnost. Redukcija DPPH• sa antioksidantom (AH) prati se smanjenjem apsorbancije pri valnoj duljini od 517nm.

Ova se metoda temelji na redukciji stabilnog radikala DPPH•, koji radi nesparenog elektrona pokazuje jaku apsorpciju u vidljivom dijelu elektromagnetskog spektra. Sparivanjem elektronskog para stabilnog radikala DPPH• u prisutnosti elektron donora (antioksidant, koji hvata slobodne radikale), ljubičasta se boja mijenja u žutu. Nastali spoj ima smanjeni intezitet apsorpcije u vidljivom dijelu spektra, a rezultirajuće obezbojenje je u stehiometrijskom odnosu s brojem sparenih elektrona.

1. 
   automatska pipeta 1000 ml,
   
2. 
   odmjerna tikvica, volumena 50ml, 100 ml,
   
3. 
   analitička vaga (METTLER),
   
4. 
   pipete 2 ml, 5 ml,
   
5. 
   lijevak,
   
6. 
   kivete,
   
7. 
   epruvete,
   
8. 
   spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).
   

1. 
   metanol,
   
2. 
   0,5 mM otopina 2,2-difenil-pikrilhidrazil radikal, DPPH,
   

U epruvetu se otpipetira 2 ml fenolnog ekstrakta, dobivenog pri određivanju ukupnih fenola, 2 ml metanola, 1 ml 0,5 mM otopine DPPH, dok se u drugu otpipetira 4 ml metanola i 1 ml 0,5 mM otopine DPPH koja predstavlja kontrolni uzorak. Za slijepu probu, uzima se otopina metanola.

Epruvete stoje u mraku 20 minuta, nakon čega se izmjeri apsorbancija pri 517nm.

Na istom uzorku, provedena su dva paralelna određivanja.

Od 30 mM otopine Troloxa prirede se razrjeđenja u odmjernim tikvicama od 25 mL u koncentracijama od 0,3 mM, 0,5 mM, 1 mM i 1,5 mM.

Iz svake tikvice otpipetira se 200 µL razrijeđene otopine Troloxa, 3,8 mL metanola i 1 mL 0,5 mM otopine DPPH. Epruvete stoje 20 minuta u mraku na sobnoj temperaturi te se mjeri apsorbancija na 517 nm uz metanol kao slijepu probu.

Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancije nacrta se baždarni pravac pomoću računala tako što se na apscisu nanesu koncentracije Trolox otopine (mM), a na ordinatu izmjerene vrijednosti apsorbancija pri 517 nm.

Na temelju podataka dobivenih u ovom radu jednadžba baždarnog pravca glasi:

y = -0,00124 x + 1,203124

R² = 0,99

gdje je:

y – apsorbancija pri 517 nm

R² – koeficijent determinacije

3.2.3.2. FRAP (eng. Ferric Reducing Antioxidant Power) metoda

Antioksidacijski kapacitet u ispitivanim uzorcima određen je prema metodi koju su prethodno opisali Connor i sur. (2002) uz određene modifikacije. Metoda se temelji na sposobnosti ekstrakta da reducira Fe ione u Fe ione u otopini 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) pri nižem pH. Redukcija se prati mjerenjem promjene apsorbancija pri 595 nm. Rezultati su izraženi kao µmol Fe ekvivalenta (FE)/mL uzorka.

1. 
   odmjerna tikvica, volumena 10ml, 50 ml, 100 ml,
   
2. 
   automatska pipeta,
   
3. 
   pipeta 2 ml, 5 ml, 10ml, 25 ml, 50 ml,
   
4. 
   čaša, volumena 50 ml,
   
5. 
   analitička vaga (METTLER),
   
6. 
   kivete,
   
7. 
   spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).
   

1. 
   40 mM vodena otopina klorovodične kiselina, HCl
   

2. 
   0,3 M acetatni pufer, pH 3,6
   

3. 
   20 mM otopina željezovog(III)-klorida, FeCl₃
   

4. 
   10 mM otopina 2,4,6-tripiridil-s-triazina, TPTZ
   

5. 
   20 mM otopina FeSO₄ × 7H₂O,
   
6. 
   30 %-tna vodena otopina etanola,
   
7. 
   30 %-tna vodena otopina metanola.
   

Ekstrakti fenola, dobiveni prilikom određivanja ukupnih fenola, razrijede se u omjeru 1:10.

U odmjernu tikvicu od 10 ml otpipetira se 240 µL destilirane vode, 80 µL uzoraka te 2080 µL FRAP reagensa. Zatim, dobro promješati, pripremiti kupelj na 37ºC te ostaviti 5 minuta. U slijepu probu otpipetirati sve osim uzorka, a umjesto njega, dodati 30%-tnu vodenu otopinu etanola.

Nakon 5 minuta, izmjeri se apsorbancija pri 595 nm.

Izrada baždarnog pravca:

Za izradu baždarnog pravca pripreme se standardne otopine FeSO₄ × 7H₂O, tako da koncentracije u odmjernim tikvicama iznose: 0, 25, 100, 250, 500 i 750 mM. Postupak je isti kao i za uzorak, samo što se umjesto uzorka dodaju priređene koncentracije otopine FeSO₄ × 7H₂O.

Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancija nacrta se baždarni pravac pomoću računala tako što se na apscisu nanesu koncentracije standardne otopine FeSO₄ × 7H₂O (mM), a na ordinatu izmjerene vrijednosti apsorbancija pri 595 nm.

Na temelju podataka dobivenih u ovom radu jednadžba baždarnog pravca glasi:

y = 0,00053372 x

R² = 0,99

gdje je:

y – apsorbancija pri 595 nm

x – koncentracija standardne otopine FeSO₄ × 7H₂O (mM)

R² – koeficijent determinacije

3.2.4. Određivanje antimikrobne aktivnosti

Antimikrobno djelovanje frakcija lavande, dobivenih različitim načinima ekstrakcije ispitano je na test mikroorganizmima koji pripadaju Zbirci mikroorganizama Laboratorija za Opću mikrobiologiju i mikrobiologiju namirnica na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu: Staphylococcus aureus 3048, Escherichia coli 3014.

1. 
   mikrotitarske pločice,
   
2. 
   mikropipete,
   
3. 
   čitač mikrotitarskih pločica.
   

Za određivanje antimikrobne aktivnosti korišteni su ekstrakti lavande korišteni za određivanje ukupnih fenola.

U jažice mikrotitarske pločice dodano je 240 µL ekstrakta ili eteričnog ulja lavande i 10 µL test mikroorganizma prethodno uzgojenog u hranjivom bujonu.

Antibakterijsko djelovanje određenih ekstrakata i eteričnih ulja lavande na test mikroorganizme, tijekom 24 h uzgoja pri 37 °C, određivano je spektrofotometrijskim mjerenjem prividne apsorbancije pri valnoj duljini 620 nm pomoću čitača mikrotitarskih pločica (Tecan, Sunrise). Razlika u prividnoj apsorbanciji kontrole (nacijepljen hranjivi bujon s test mikroorganizmom bez dodanih ekstrakata i eteričnih ulja lavande) i uzoraka s dodanim ekstraktima i eteričnim uljima lavande mjera je inhibicije rasta test mikroorganizma. Slijepe probe su bili uzorci pripremljeni bez dodatka mikroorganizama.