Ssr analysis of Phylogenetic Relationship and Genetic Diversity for
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英文缩略表
第一章 论文综述苹果（Malus domestica Borkh.）属蔷薇科（Rosaceae）、苹果亚科（Maloideae）、苹果属（Malus Mill.）。世界苹果属植物资源约35个种，广泛分布于北温带，亚洲、欧洲和北美洲；而原产中国有23种之多（未含近年来新发现的种），其中野生近缘种17种，栽培或半栽培种6种（俞德浚，1979；贾敬贤等，2006）。苹果属种质资源的各类种质，如：野生、半野生、栽培品种、以及抗源材料等十分丰富，在研究苹果属种质资源的起源、亲缘演化以及遗传多样性等方面居重要地位。 世界苹果属植物的野生种，因生态地理条件的不同，起源演化的先后亦各有不同，大体在东南亚、中亚、西亚、欧洲和北美洲按纬向界限形成明显的五大基因中心。各个基因中心皆有其特定的代表种和大量的多型性类型，综合形成世界苹果属植物纬向不均匀分布的五大基因中心。起源于东亚的18个种，包括起源于日本的1种；起源于西亚高加索的1种；起源于欧洲的3种；起源于美洲的4种，共27个代表种。其中，亚种、变种和变型不计，形成五大基因中心。在五大基因中心中，以东亚基因中心的中国种类最多，共17种。因此中国是世界苹果属植物最大的基因中心，尤其是中国西南的四川、云南和贵州三省。（李育农，1999） 中国苹果起源于新疆野苹果（塞威士苹果），西洋苹果则起源于中亚塞威士苹果。中国苹果与西洋苹果虽有共祖关系，但两种自古以来就是在完全隔绝的生态地理条件下生长繁衍，原始的种质基因虽相同，但其形态上的特征特性有着明显的差异，两者皆属驯化而来的栽培种。西洋苹果掺有其他种的基因，比中国苹果较为进化。现代的西洋苹果国内通称为苹果M.domestica Borkh,其品种在全世界约有3000余种。自从1871年栽培苹果引入中国后，百余年来逐步取代了中国苹果（绵苹果）和沙果等栽培品种。但中国苹果及其近缘种的栽培历史至少可以追溯到西汉时期，已有两千多年的历史。 种质资源是现代育种和生物技术研究的物质基础。有关苹果属种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究将为探讨苹果属植物的起源、进化、分类、育种和资源利用等方面提供科学依据。苹果分类及亲缘演化关系已成为许多国内外学者研究的对象。对苹果属植物进行较系统的研究，国外始于17世纪70年代的林奈，而国内则始于20世纪50年代的俞德浚。对苹果属种质资源的演化和分类的研究，以往主要从形态学、细胞学、孢粉学和同工酶等遗传标记方面展开工作，直到近年来出现的以DNA为对象的分子标记法，取得了显著的研究成果。 1．1苹果属种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究进展1．1．1亲缘关系和遗传多样性的形态学研究形态学是根据植物个体间形态性状的差异对植物进行分类，是最直观传统的研究方法。它是利用那些在植物的生长发育过程中，可用肉眼观察到的形态特征，是基因型的表现型。因其便于观察和获取，形态变化多样，具有较长的研究历史，其分类系统的建立需要很多系统的性状观察和指标作为依据(俞德浚，1979)。 我国苹果进化和分类的研究，从形态学入手作了大量的工作。最初以产地和树型上的区别为分类依据到花、果等生殖器官的性状研究，发展到运用数量分类进行综合分析。俞德浚1956年应用了Rehder A.分类系统的框架对中国原产的15个野生种和5个栽培种进行了中国苹果属植物的描述；1974年在中国《中国果树分类学》中，列举了中国苹果属植物的种类。1984年王宇霖将世界苹果属植物分为两个亚属：真苹果亚属Subgenus Eumalus(Zabel) Wang与花楸苹果亚属Subgenus Sorbomalus (Zabel) Wang。1989年Alwinckle以Huchins(1972)的Ph D.论文为基础，综合了Darlington等多人关于苹果属植物分类的主张，在Rehder A.分类系统的基础上，调整了一些组和系，增加了一些野生种和栽培种，建立了苹果属组和原种的系统，其中最突出的变动是将Rehder分类系统中的花楸苹果组下的陇东海棠系与滇池海棠系提出来合成陇东海棠组，而原有的花楸苹果组下只剩下意大利海棠一个种。在苹果系中增加了东方苹果和家植苹果，并接受了俞德浚在全属植物增加的9个种，只略去了丽江山荆子一种。由Rehder原定的25种，增加到33种。1991年兰氏将世界苹果属植物扩充为6组、11个系、58个种。 大多数果树种质鉴定主要依据所研究树种中最鲜明的形态特征进行区分、分类和命名，对种质资源保存和利用也是以观察的种质外部形态优异性状为依据。但是性状是基因和环境共同作用的结果，形态性状尤其是营养器官最易受环境修饰而发生变化，在环境条件不适宜时，反映不出很好的结果，而且形态学性状在品种水平上的形态学差异很少，有时无法进行品种鉴定，因此，形态学标记已明显不能满足亲缘关系鉴定的要求。
1.1.2 亲缘关系和遗传多样性的孢粉学研究孢粉学是形态学的一个分支，花粉形态特征是受植物基因控制，而不受外界条件影响（高锁柱，1988；Harrison,1968），是探讨起源、演化及亲缘关系的重要特征之一，随着扫描电子显微镜的出现和应用，使孢粉学研究进入一个崭新的阶段，其不仅可以用于种的鉴定，还可用于品种群的划分和品种鉴定。许多学者在应用孢粉学方法进行果树种质资源鉴定方面作了许多研究。 孢粉学的花粉形态观察可用于区别树种和分析植物的进化程度。成明昊等（1986）提供中国苹果属20种植物的花粉，杨晓红进行了电镜扫描的形态观察，并计算其赤道轴E与极轴P之比（P/E值），发现苹果属植物大多数种类的花粉为长球形，纹饰条网状，萌发孔不外露，沟浅，极面观为三叶圆形，P/E值大；但苹果系Pumilae Redh.种类花粉近球形，纹饰条状，萌发孔不外露，沟深，极面观为三叶形，P/E值小；而山荆子系Baccatae Redh.花粉则呈长球形，P/E值较大。因此看出本属植物通过花粉形态可以推测其演化路线是由P/E值大到P/E值小，花粉外壁纹饰是由网状到条状。杨晓红（1992）通过扫描电镜观察李育农和林培均提供的新疆野苹果的29个不同类型植株的花粉，得出新疆伊犁河上游的野苹果较下游为原始的推断。之后杨晓红（1993）进行扫描观察李育农和Ponomarenko提供的中亚和东欧的苹果野生种花粉，结果看出P/E的关系：中国新疆新源塞威士苹果>霍城塞威士苹果>中国绵苹果>中亚塞威士苹果>东欧森林苹果>东方苹果。而贺超兴等（1991）亦选择了花粉外壁纹饰的特征作为全属植物分类的依据，引证Walker(1974) 的论断，认为植物花粉表面纹饰的演化趋势是由表面光滑－表面网状－表面疣状、刺状。从而得出苹果属植物花粉外壁纹饰是从条纹型向网状型发展。因此推测苹果组最为原始，多胜海棠较为进化，花楸苹果组最为进化。而这与形态分类、核学分类、化学和酶学分类的进化观刚好相反。之后，凌裕平等(1996)对4个苹果短枝型品种及其相应的起源品种的花粉形态进行比较研究发现：（1）苹果花粉形状相似，但大小存在着差异，所测品种中普遍表现为短枝型品种的花粉显著小于起源品种；（2）苹果品种花粉表面纹饰较复杂，主要分两类：红星和新红星属于同一类型，其花粉粒表面为网状纹饰；而金帅、金矮生；青香蕉、烟青；印度，绿光同属于一个类型，其花粉粒表面为条纹纹饰，走向与极轴基本平行；（3）短枝型品种花粉中出现异型花粉；（4）苹果花粉在形态构造上属于NPC系统中的N3P4C2类型。 因此应用孢粉学方法进行果树种质鉴定分类时要注意制样方法的影响（陈学森等，1992），并且即使同一品种内花粉粒之间也存在个体差异，所以如果仅以个别花粉形状的差异作为分类鉴定依据时并不可靠，必须结合其他指标进行综合考察。
1.1.3 亲缘关系和遗传多样性的细胞学研究细胞学方法是20世纪30年代兴起的一种利用染色体数目、核型、分带带型、减数分裂等进行分类的方法，这种方法也被广泛地应用到果树资源的鉴定中（胡志昂等，1991）。由于多倍体在果树育种和应用中的重要性，对染色体进行观察可以直观发现和鉴定果树种质资源中的多倍体，从而迅速应用到果树遗传育种和生产中。 苹果属植物的染色体分类研究，自20世纪20年代开始，近一个世纪以来，通过国际上10余位学者的努力，世界苹果属植物的40余个代表种的染色体数目、倍性与染色体减数分裂行为得到了基本查清。按照Stebbin(1971) 核型分类的原则，梁国鲁（1993）以平均臂比值为根据，将中国苹果属植物染色体分为2A、2B和3B三大类型。之后，梁国鲁（1996）在小孢子染色体减数分裂的研究中，通过综合比较将苹果属植物染色体的联会构型也分为三类：以单价和二价体为绝对优势的真苹果组的八个种，有山荆子、丽江山荆子、锡金海棠、垂丝海棠、苹果、花红、西府海棠和楸子，构型交义频率为15－17；以单价体、二价体和一个四价体为主的花楸苹果组中陇东海棠系的三个种，陇东海棠、变叶海棠和花叶海棠，构型交义频率19.00；花楸苹果组下滇池海棠系的沧江海棠与河南海棠，多胜海棠组下的尖咀林檎，有17个二价体，构型交义频率变幅为20－20.5。 染色体研究的实验条件相对简单，得出结果快，尤其是结合分带技术可揭示出大量染色体结构的变异，但是由于染色体制片技术和分辨率的限制，核型分析应用于品种鉴定和系统分类还有一定的难度。对于大多数具有小染色体和结构差异较小的果树植物来说，染色体核型分析还不足以达到进行品种鉴定的目的。但是随着植物染色体制片技术的日益成熟和各种分带技术、染色体原位杂交技术等的发展和应用，细胞学方法在将来可能会成为果树品种资源鉴定的一个有效手段。
1.1.4 亲缘关系和遗传多样性的化学研究1981年英国朗艾斯顿研究站William通过苹果属植物叶片和皮层中酚类物质的检测，发现二氢苯基、乙烯酮根皮甙和八种类黄铜物质（flavonoides）分别在苹果属植物不同种中出现，可以作为检测种间亲缘关系的指标，从而对不同的分类系统加以比较和进行化学鉴定。检测后，William对Rehder分类的大体框架体系构成没有提出不同意见，但针对许多种如楸子、三叶海棠、多花海棠、意大利海棠、变叶海棠等在分类中的地位，提出了一般形态分类上没有发现的问题，从进化系统上William同意多胜海棠组 Docyniopsis最为原始，其他为衍生组和较进化系统，尤以苹果组Eamalus 最为进化。前苏联作物所（1986）应用生化性状的多元分析，研究苹果属植物种间亲缘关系。并初次使用酚类化合物组成数量的24个指标。结果认为将主要分量法应用于澄清本属植物的种、系、组之间的关系是适当的，认为苹果属按Koehne-Koidzumi分为脱萼与宿萼系统和Rehder-Langenfelds的进化系统的两种分类都具合理性。 1.1.5 亲缘关系和遗传多样性的同工酶研究生化分析用于系统多态性研究主要是同工酶的研究，自1959年Market和Moller首次提出同工酶概念以来，同工酶的研究已被广泛用于遗传学的研究和系统发育学的研究。同工酶即酶的多种分子形态，是指那些具有相同活性而分子结构及理化性质不同的酶蛋白分子。在高等植物中普遍存在，与性状表现有直接关系，被称为第二遗传信使。植物体内的同工酶在一定的部位、一定发育时期，其酶谱存在着相对的稳定性，它在一定程度上能够反映植物个体间的遗传差异，故同工酶作为鉴别树种和品种遗传性状的指标之一，已应用于研究树种和品种的起源、演化及分类等方面。同工酶进行种质资源研究具有如下优点：(1)避免趋同进化和功能相关等问题；(2)谱带简单明确，较主观性；(3)受环境影响较少，不存在加权问题；(4)共显性，可以区分杂合和纯合；(5)实验设备简单，材料来源丰富，成本较低，分析时间快且结果便于比较。 程家胜（1986）根据过氧化物酶同工酶酶谱特征构建苹果属13个种类的亲缘关系树状图。肖尊安等（1989）进行了苹果属17个种类酯酶同工酶和谷氨酸脱氢酶同工酶的模糊聚类分析。李育农、李晓林（1995）应用过氧化物酶同工酶电泳，对世界苹果属植物44个材料，就酶带数目的多少和酶活性的强弱，系统检测了Zabel(1903)、Schneider(1906)、Rehder(1940)、和Langenfelds(1991)对世界苹果属植物分类系统的准确性，权衡了世界具有代表性的44个苹果属植物试材在分类学上的地位。董绍珍等（1987，1989）也对苹果属植物的分类系统的准确性进行了检测并提出了植物分类应以野生种为主，苹果属应该保留塞威士苹果、东方苹果和森林苹果三个种；支持Langenfelds改真苹果组Eumalus Zahd.为苹果组Baceatus Langenf；取消苹果系Pumilae Rehd与山荆子系Baccatae Rehd。将山荆子系提为山荆子组Baceatus Jiang；三叶海棠系与滇池海棠系各自种间酶谱相似。但陇东海棠系种间酶谱明显不同，亲缘关系差；意大利海棠酶谱特殊，可以保留Rehder A.定的意大利海棠系；三裂叶海棠组过氧化物酶酶谱简单，但染色体又为多倍体（2n＝4x＝68）不似原始种，尚须研究；锡金海棠与湖北海棠酶谱较为相似，置于山荆子组中比多胜海棠组中较确切。 据前人的研究可知，同工酶在果树种质资源鉴定上作出了很大的贡献，但也存在很大的局限性，原因是同工酶研究受到很多因素的影响。一方面同工酶作为标志受到外界条件的影响，也就是不同器官之间、同一器官的不同发育期之间酶谱，不同的同工酶系在同一器官表现不同。因而同工酶的研究结果受到环境、取材时期和部位等的影响。另一方面同工酶用于系统分析和分类研究存在信息量不足等问题。
1.1.6 问题及展望苹果属种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究，以往主要从形态学、细胞学、孢粉学、酶学等方面进行的。尽管这些都是遗传本质的表现，但在遗传本质表现的过程中，环境因素的确起了过大的作用。所以，其结果虽然整体上相似，但存在具体的差异性，并且形态学研究过于宏观，所能提供的信息有限；细胞学的染色体核型分析及孢粉学的花粉形态的观察，虽然在鉴别种质及探讨其演化方面起到了很好的作用，但它们在演化过程中，具有一定的保守性，同样存在提供信息量不足的问题；酶学，虽然能给出一些多态位点，但它是基因表达的产物——蛋白质，仍不能克服人为因素和环境因子的影响。DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记等遗传标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记形式。90年代以来，随着分子生物学技术的发展，DNA多态性的分子标记在植物亲缘关系的研究上取得了突破性进展，也为苹果属植物的研究指明了方向。近几年来用于分析苹果属种质资源亲缘关系和遗传分类的标记有SSR、RAPD和AFLP。SSR虽然需要以目的基因组DNA序列信息为基础，作为DNA 指纹技术的应用受到一定程度的限制，但是SSR设计的引物可以实现各实验室共享，并且有研究表明从栽培苹果上开发的SSR引物可用于蔷薇科内更多跨种、跨属的种质资源的研究，而且不同的SSR标记所表现出的多态性有较大的差异。RAPD分析虽然也产生和AFLP技术相似的系统树图，但结果稳定性、重复性差。SSR技术可以克服这两缺点，其DNA用量少、对DNA的纯度要求比较低，并且具有结果稳定、重复性好，简便易行、多态性检出率高等优越性。所以，SSR技术在苹果种质资源的分析上更具有着广阔的应用前景。 |