Ssr analysis of Phylogenetic Relationship and Genetic Diversity for
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2.2 方法2.2.1 基因组DNA的提取以春季枝条萌发嫩叶为材料，采用改良的CTAB法（Doyle等，1990；邹喻苹等，2001；赵玉军等，2002；陈昆松等，2004）提取苹果总DNA。 （1）在小研钵中加入0.3g去掉叶柄和主脉的幼嫩叶片，再加1~2%巯基乙醇及2mlCTAB提取缓冲液，研磨至无可见的组织，快速移入2.0ml离心管中； （2）65℃恒温水浴锅温浴中细胞裂解30～60min，期间上下颠倒离心管1~3次； （3）12000rpm离心5min，吸取上清后加入等体积CI （氯仿：异戊醇=24：1），轻轻混匀，12000rpm离心10~15min，重复2~3次，至中间界面比较清澈、无可见杂质； （4）吸取上清，加入1/10倍体积的 3M NaAC和0.7倍体积的冰冻异丙醇（或2~2.5倍体积的冰冻无水乙醇），小心混匀； （5）放入-20℃冰箱静置30min；将管中的絮状沉淀轻轻挑出，放入新的离心管中（或13000rpm离心15min，倒掉上清液）； （6）加70%乙醇300~500μl，洗涤沉淀1~3次，洗时沿壁缓慢转动几次； （7）室温下干燥，至沉淀无乙醇味时溶于20~50μl TE（10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0）溶液中，待DNA溶解后放入-20℃冰箱保存。 2.2.2 基因组DNA浓度与纯度检测（1）用紫外分光光度计进行测定：DNA在260nm处有一吸收高峰，根据A260值可估测浓度（A260=50μg/ml），而A260/A280比值则可估测其纯度（纯DNA溶液的A260/A280值应为1.8±0.1）。 （2）电泳法：用0.7％琼脂糖凝胶电泳，观察样品DNA条带是否清晰，有无降解，是否还含有糖类或RNA等杂质，并对照 DNA标准条带估测样品DNA片段的大小，对照λDNA（10ng/ul）估测提取基因组DNA的浓度（ng/ul）。 2.2.3 SSR反应技术体系2.2.3.1 基因组DNA浓度的调整 根据基因组DNA原液浓度与纯度的检测结果，将基因组DNA原液按倍数进行稀释。通过琼脂糖凝胶电泳，对照λDNA（10ng/ul）将DNA的亮度调为一致，浓度为20 ng/μL。 2.2.3.2 SSR引物的筛选 SSR引物按Liebhard等（2002）报道的序列由上海Sangon公司合成。由于，实验中所采用的试材包含了栽培品种、地方品种、新疆的野生苹果、野生种或其变种，因此必须对引物进行筛选。由20对引物筛选出稳定性强、多态性好、分辨率高的引物进行正式的实验。 2.2.3.3 SSR扩增条件的优化 SSR反应体系经优化确定为：20µl反应体系含20～40ng基因组DNA，Tris–HCl 10 mmol/L (25℃，pH9.0) ,KCl 50mmol/L，MgCL21.5mmol/L，dNTP0.2 mmol/L，引物0.5µmol/L，Taq聚合酶1U。PCR扩增反应在美国PE公司生产的PTC100基因扩增仪和Biometra梯度PCR仪上进行。 扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，64～55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。而有的引物需要采用降落PCR进行扩增，扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性1 min，起始60～58℃退火1 min，72℃1min，10个循环，其中每个循环降0.5℃；94℃1 min，降落至最后的温度退火1 min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。不同引物扩增所需要的退火温度不同，因此需要经过实验确定其退火温度。 2.2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.2.3.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 （1）清洗、硅化玻璃板 本试验使用的是氟化玻璃板（35cm×45cm）。将平板和凹板在自来水下用玻璃清洗剂清洗干净，再用蒸馏水冲洗，晾干。在灌胶面喷少量无水乙醇，用无尘纸擦干净。在灌胶面，用稀释好的亲和硅烷（亲和硅烷原液：无水乙醇＝1：200）擦拭平板2～3遍放，用剥离硅烷擦拭凹板2～3遍，晾干。保证玻璃板上无灰尘和油污等印记。将平板平放（灌胶面向上），在其边缘放好间隔条（4 mm），将在其上压凹板（灌胶面向内），玻璃板对齐并用夹子固定好，然后斜放在灌胶架上，准备灌胶。 （2）灌胶
量取70mL 6.%的事先配好的聚丙烯酰胺原胶液，加入30μL TEMED（四甲基乙二胺）和300μL 10%的APS（过硫酸铵）（可以通过调节TEMED和APS的加入量而调节胶凝速度），充分混匀后，立即用去掉针头的注射器沿凹板上沿的一侧均匀地灌胶，使胶液流动的最前端尽可能成一条直线，待胶液从底部流出后迅速将玻璃板放平，将鲨鱼齿梳子（62孔）无齿的一侧插入并压紧，凝固2 h。 （3）清理玻璃板及胶面 胶凝固后，拔出梳子，用吸水纸吸干胶面上的水，将玻璃板外壁和水平胶面上的碎胶清除干净。去掉固定玻璃板的夹子，将玻璃板固定到垂直板电泳槽上，准备电泳。 2.2.3.4.2 电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳利用北京君意东方电泳设备有限公司生产的JY5000型多用途电泳仪和JY-CX2B（改进型）型DNA测序电泳槽上进行的。 （1）预电泳
固定好上、下电泳槽及胶板，电泳槽各加入500 mL 1×TBE缓冲液，用移液器清理胶面上的杂质，将上下电泳槽盖好并连接好电源线，电压1700V、功率70W预电泳30min。 （2）点样
预电泳结束后，用移液器再一次清理胶面上的杂质，正向插入鲨鱼齿梳，齿尖插入胶面1mm即可。将9ul（3ul甲酰胺上样缓冲液、6ulPCR扩增产物）变性好的样品（94℃变性5min）按顺序依次点入点样孔中。 （3）电泳
盖好电泳槽盖并连接好电源线后，开始电泳。根据扩增产物分子量大小，通过调节电泳的电压和功率调节电泳时间，一般采用电压1700V、功率70W电泳2h。 2.2.3.5 银染检测 根据Bassam等（1991）的银染检测方法包括：脱色、冲洗、染色、显影、定影、再冲洗基本步骤。 （1）脱色固定：电泳结束后，玻璃板卸下，将凹板撬起并拿下。在塑料脱色盒中加入10％的醋酸固定液，将平板胶面向上，放入脱色盒中，轻摇至颜色消失为止。 （2）冲洗：在干净的塑料盒中加入蒸馏水洗胶2次，每次2min。 （3）染色：在塑料染色盒中加入含1mg/mlAgNO3、1.5ml/L 37％甲醛（1.5g AgNO3、2.25ml 甲醛加入到1.5L蒸馏水中）的染色液，将平板放入其中轻摇染色30min。 （4）显色 ①显色液的制备：将含有30mg/mlNaCO3的显色液1.5L放到4℃冰箱中冷藏。于显色前取出倒入显色盒中，加入2.25ml 37％甲醛和300ul 10 mg/ml Na2S2O3。 ②显色：在干净的塑料盒中，用蒸馏水迅速洗胶一次，时间不超过10S。然后，将平板迅速地放入显色液中，轻摇显色。 ③终止显色：至胶上条带清晰可辨时，用10％的醋酸溶液终止显色。 （5）定影：用蒸馏水清晰平板2次，取出后放于室温下自然晾干。
2.2.4 结果统计与分析方法每对SSR引物检测1个位点，每条多态性带为1个等位基因，有带记为1，无带记为0。位点的杂合度h＝1－∑xi2，其中xi表示第i个等位基因的频率。遗传多样性指数H＝∑h/n。用NTSYS-pc2.10e软件对数据进行分析，采用Dice相似系数，以非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析。其中相似系数: S=2Nxy/(Nx+Ny) Nx:为所有引物在材料x中出现的条带数目；Ny:为所有引物在材料y中出现的条带数目;Nxy:为所有引物在材料x和Y中同时出现的多态性带数目。
第三章 结果与分析3.1 提取基因组DNA的质量基因组DNA的成功制备和避免部分降解是SSR成功的基础和关键，因为模板的质量即其中是否含有多糖、多酚、蛋白质、醌类及色素等物质将影响以后的PCR扩增反应。 本实验采用改良的CTAB法提取苹果基因组DNA，用紫外分光光度计检测，供试材料的OD260/OD280值均在1.8±0.1，用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，主带清晰，无降解，纯度较高，达到SSR分析的要求。结合OD260值及λDNA/HindⅢ分子量标准将DNA样品的浓度调为一致，浓度为20ng/μL。 3.2 SSR引物的筛选与多态性3.2.1 SSR引物的筛选20对引物中筛选出，用于正式实验的稳定性强、多态性好、分辨率高的12对引物为CH01f03b、CH02b121、CH03d07、CH02a04、CH05b06、CH05d04、MS06g03、CH04a12、CH04h02、CH05c06、CH05d08、CH02g04。引物编号及序列见表3.1。 表3.1 筛选出SSR扩增引物 Table 3.1 Primers screened out for amplication
3.2.2 筛选出的SSR引物扩增条件的优化在梯度PCR仪上，将筛选出的SSR引物在不同退火温度下扩增，用3％的琼脂糖电泳检测、比较不同退火温度下扩增产物的质量，得出各对引物所需要采用的PCR程序及最佳退火温度（见表3.2）。 表3.2 引物退火温度 Table 3.2 Annealing temperature of Primers
3.2.3 SSR引物的多态性利用筛选出的12对引物对59份苹果材料进行扩增，获得176个等位基因。不同引物扩增的等位基因数10～18个不等，平均每个位点14.7个等位基因。位点杂合度在0.4039～0.7412之间，遗传多样性指数为0.6156（表3.3）。 表3.3 12对SSR引物对59份苹果材料的扩增结果 Table 3.3 Amplified results of 59 apple accessions with 12 SSR primers
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