Ssr analysis of Phylogenetic Relationship and Genetic Diversity for
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3.3 SSR指纹图谱和品种鉴定传统的品种鉴定的方法多是依据形态学、细胞学、孢粉学和同工酶等方面进行分析，但在这些遗传本质表现的过程中，发育阶段和环境因素的确起了过大的作用。从分子遗传角度来看，表型的差异归根到底是基因型的差异。因此DNA序列的差异可以作为品种鉴定的直接依据，而建立品种的指纹图谱是在分子水平进行品种鉴定的基础。SSR指纹图谱显示不同树种或品种之间微卫星重复单位碱基组成、拷贝数及多态性的差异，多态性丰富、稳定性和重复性较好，可以高效准确地进行品种鉴定。引物对CH02a04和CH04h02在供试的59份苹果材料中扩增等位基因数均达18个，分别可以区分其中的44份和42份材料，区分率分别为74.6％和71.2％；用3对SSR引物，即CH02a04、CH02g04和CH01f03b，可将供试的59份苹果材料区分开。用引物CH04h02和CH01f03b可区分供试的17个栽培品种；引物CH01f03b可区分供试的10份新疆的野生苹果；引物CH02a04可区分供试的13个地方品种；引物CH05d04可以区分19份野生苹果材料中的18份，区分率达到94.8％。引物CH01f03b扩增出13种栽培品种的指纹类型，津轻、金冠和乔纳金，君袖、嘎拉和紫香蕉分别具有相同的指纹类型；即有4个品种和另外的品种无法区分。（见图3.1~3.4。） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 3738 39 4 0 4 142 43 44 45 46 47 4 8 4 9 50 5152 53 54 55 56 57 58 59 M 
190bp
180bp 160bp 147bp 图3.1 引物CH01f03b对59份苹果材料扩增电泳图 编号见表1，下同。M：pBR322 DNA/MSP1 Markers Fig. 3.1 Amplification of primer CH01f03b in 59 apple accessions The same code No. as in Table 1. The same bellow. M：pBR322 DNA/MSP1 Markers 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 0 4 142 43 44 45 46 47 4 8 4 9 50 5152 53 54 55 56 57 58 59 M 
242 bp
238 bp 217 bp 201 bp 190 bp 180 bp 160 bp
图 3.2 引物CH04h02对59份苹果材料的扩增电泳图 编号见表1，下同。M：pBR322 DNA/MSP1 Markers Fig. 3.2 Amplification of primer CH04h02 in 59 apple accessions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 0 4 142 43 44 45 46 47 4 8 4 9 50 5152 53 54 55 56 57 58 59 M 
242 bp 238 bp
201 bp 190 bp
180 bp 160 bp
图 3.3 引物CH04e03对59份苹果材料的扩增电泳图 Fig. 3.3 Amplification of primer CH04e03 in 59 apple accessions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 0 
图 3.4 引物CH05c06对前40份苹果材料的扩增电泳图 Fig. 3.4 Amplification of primer CH05c06 in 40 apple accessions 3.4 聚类分析根据12对引物的扩增数据，用NTSYS-pc2.10e软件对数据进行分析，采用Dice相似系数，以非加权类平均法（UPGMA）进行聚类。（见图3.5） 59份材料的相似系数在0.7226～0.9935之间，平均值为0.8070（见附录1）。由图3.5可以看出，59份材料均能分开，在相似系数为0.803处可以分为3个类群，与起源演化相关。类群Ⅰ包括全部的野生种，这些野生种在起源上都比较原始；类群Ⅱ包括全部供试的新疆的野生苹果和地方品种，说明了新疆的野生苹果与地方品种的亲缘关系较近，起源相对较早的新疆的野生苹果与地方品种有一定的演化顺序关系；类群Ⅲ由全部供试的栽培品种以及两个地方品种牛妈妈海棠和崂山奈子组成的，同属欧亚苹果组的全部栽培品种聚在一起说明它们都具有较近的血缘，与传统的系谱基本一致，而本属于地方品种的崂山奈子和牛妈妈海棠则可能更接近于栽培品种。 聚类的结果未能完全体现杂交后代与亲本之间的亲缘关系。例如：富士和国光、嘎拉和金冠没有紧密地聚到一起。这原因可能有三，一是由于由共同亲本所带来的相似性远超过其他因素的作用；二是苹果的高度杂合导致亲缘关系较近的品种间产生复杂的遗传多样性；三是检测位点不足，所检测位点不能够充分反映其间的亲缘关系。而这与王爱德等的研究结果相一致。
图3.5苹果供试材料的聚类分图 Fig. 3.5 Dendrogram of apple accessions based on SSR data
3.4.1 栽培品种的亲缘关系和遗传多样性分析具有亲本血缘的栽培品种被紧密的聚在一起，并且具有相同亲本起源的品种相似系数也较高，体现出它们之间的较近亲缘关系。例如：嘎拉（（元帅×橘苹）×金冠）和富士（国光×元帅）、乔纳金（金冠×红玉）和东光（金冠×印度）、津轻（金冠×红玉）和金冠相似系数分别达到0.8903、0.9161和0.9226。此外，未紧密聚到一起但是具有相同亲本的品种也具有较高的相似系数。例如：嘎拉和乔纳金、嘎拉和东光、嘎拉和津轻、乔纳金和津轻的相似系数分别达到0.8839、0.8645、0.8710、0.8968。津轻与母本金冠聚在一起，说明其更多地遗传了来自于母本的遗传因素。而乔纳金与亲本金冠相似系数0.9097远高于与亲本红玉的相似系数0.8581，证明其也是更多遗传了金冠的遗传物质。 3.4.2 新疆的野生苹果与地方品种的亲缘关系和遗传多样性分析新疆的野生苹果与地方品种在聚类上相互交错，即体现了新疆的野生苹果在起源上的重要性又体现了新疆的野生苹果与地方品种之间的密切的关系。新疆野苹果与其亚种吉尔吉斯苹果和其变型新疆红肉苹果的相似系数分别为0.9613和0.8065，可见新疆野苹果与吉尔吉斯苹果间具有更近的亲缘关系，起源较早。绵苹果与其变种楸子以相似系数0.9097紧密地聚在一起，两者又与新疆野苹果的变型新疆红肉苹果聚在了一起。绵苹果与新疆的野生苹果阿留斯坦、金沙依拉姆、新疆红肉苹果、冬白果、克孜阿尔玛和霍城白果子等聚在一起，相似系数分别为0.8387、0.8387、0.8258、0.8654、0.8452和0.8323，亲缘关系较近。花红与中国彩苹紧密的聚在了一起，而中国彩苹与黄甜果相似系数达到了0.9935。花红与楸子的相似系数为0.8194，更证明了其近缘性。槟子是绵苹果系的多型性种类之一，其与绵苹果的相似系数为0.8065；而香果虽与绵苹果的性状较为相近，两者的相似系数为0.7871，槟子比香果具有的更早的起源。 3.4.3 野生种或其变型的亲缘关系和遗传多样性分析野生苹果的历史久远，要研究其起源演化比较复杂，并且即使是同一种内也因地理位置的不同而出现许多变种和变型。三叶海棠的两个地方类型维西三叶和卢氏三叶海棠、湖北海棠的两个变种兴山湖北海棠和平邑甜茶、变叶海棠的两个地方类型小金变叶和雅江变叶海棠被分别聚到了一起，相似系数分别为0.8387、0.8452和0.8710。而变叶海棠的两个变种与垂丝海棠和湖北海棠的变种聚在一起，亲缘较近。山荆子与其亚种毛山荆子、地理亚种丽江山荆子和地方类型扎矮山荆子被聚到一起。西府海棠与其亲本之一山荆子的相似系数是0.8129，而八楞海棠则与山荆子、丽江山荆子、毛山荆子和扎矮山荆子聚在了一起，表明了西府海棠与八楞海棠较近的亲缘关系。变叶海棠的两个变种雅江变叶海棠和小金变叶与山荆子组供试的六个品种的相似系数的平均值分别为0.8268和0.8011，而与陇东海棠的相似系数分别为0.8194和0.7806。 第四章 讨论4.1 SSR指纹图谱分析和品种鉴定传统的品种鉴定的方法多是依据形态学、细胞学、孢粉学和同工酶等方面进行分析，但在这些遗传本质表现的过程中，发育阶段和环境因素的确起了过大的作用。从分子遗传角度来看，表型的差异归根到底是基因型的差异。因此DNA序列的差异可以作为品种鉴定的直接依据，而建立品种的指纹图谱是在分子水平进行品种鉴定的基础。SSR指纹图谱显示不同树种或品种之间微卫星重复单位碱基组成、拷贝数及多态性的差异，多态性丰富、稳定性和重复性较好，可以高效准确地进行品种鉴定。筛选出的12对SSR引物共获得176个等位基因。不同引物扩增的等位基因数10～18个不等，平均每个位点14.7个等位基因。每对引物扩增条带全部为多态性条带，位点杂合度在0.4039～0.7412之间，遗传多样性指数为0.6156。引物扩增位点特异性强，获得的指纹类型差异明显，可以极大地丰富供试材料的指纹。供试的不同苹果属种质资源材料在不同基因位点的指纹类型均可在聚丙烯酰胺凝胶电泳图上清晰、准确的显现出来，便于进行品种鉴定和亲缘关系分析等。 果树为多年生作物，多为无性繁殖，并且发展历史悠久。在长期的进化发展以及不同地域间频繁交流过程中，同物异名和同名异物的现象非常普遍。以往的品种鉴定主要是根据其某一特征进行的，大部分是以形态学为基础，但是基因在表达过程中容易受环境因素的影响，所以，单以形态学特征为依据进行品种鉴定，其准确性往往不是很高，有的甚至难以区分。DNA序列的差异能够从本质上反映个体的差异，利用品种的指纹就可以对品种进行准确鉴定，而且高质量的指纹图谱还可以作为新品种登记、注册和产权保护的依据。本实验建立了59份苹果属种质资源材料的SSR指纹图谱，在筛选出的12对引物中，利用其中的3对引物即可区分全部供试材料。而17个栽培品种、10个新疆的野生苹果品种、13个地方品种和19个野生种或其变型分别仅用2对、1对、1对和2对SSR引物即可区分，区分率较高。王爱德等（2005）也曾经利用2对SSR引物鉴定区分了25个苹果栽培品种。依据不同品种或类型在不同的位点所具有特异指纹可以快速的进行品种鉴定，而且鉴定的准确率高。 |
