Ssr analysis of Phylogenetic Relationship and Genetic Diversity for

1.2 DNA分子标记及其在苹果属种质资源研究中的应用

1.2.1 DNA分子标记技术的分类

1.2.1.1 以电泳技术和Southern杂交技术为核心的分子标记

其代表技术是RFLP，其利用限制性内切酶酶解DNA后，用特异探针进行Southern杂交，放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。共显性标记，可区分纯合子和杂合子；结果稳定、可靠性高。但DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。

1.2.1.2 以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记

PCR技术即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，自Mullis等1985年首创以来，其便捷、快速和高效的特点在分子生物学研究中得到广泛应用。根据使用引物的特点可分为两类：

1.2.1.2.1 随机引物PCR

其代表技术为：RAPD,DNF, SPAR等。所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性，操作简单；引物价格便宜，成本较低；但稳定性差；为显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子。

1.2.1.2.2 特异引物PCR

这类技术有：SSR，SCAR，STS，AFLP等。通过特异双引物有选择性的扩增基因组DNA或基因组DNA限制性酶切片段，揭示被扩增区段的多态性。多态性极高，分辨率高；重复性好，结果可靠；其实验条件及操作技能要求较高。

1.2.2 分子标记技术在苹果属种质资源研究中的应用

种质资源的遗传多样性是生命系统的基本特性，是物种适应自然和发生进化的遗传基础，也是育种的重要保证。苹果属种质资源极为丰富，包括大量的野生种和栽培种。利用分子标记进行种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究，已经证明是一种很有效的方法。Dunemann等（1994）应用RAPD分子标记技术对苹果属17个野生种间的亲缘关系进行了研究，并构建了相应的聚类分析树状图。Nnadozie（2001）利用RAPD分析苹果属种质资源的遗传多样性及相互关系。王涛等（2001）在构建AFLP指纹图谱的基础上，分析了我国及世界苹果生产中20个重要苹果砧木间的遗传差异和亲缘关系；绘制亲缘关系树状图，表明苹果属（Malus Mill.）中的两个苹果亚属的砧木被分别聚成了两个大组，即花楸苹果亚属大组（Sorbomalus Zabel.）和真正苹果亚属(Eumalus Zabel.)大组；前者包括拥有河南海棠血统的4个砧木，后者M系、MM系矮化砧木自成一个聚类小组。

1.2.2.2起源与进化的研究

物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。遗传关系越近，基因组DNA差异越小，反之，差异越大，从而确定它们的亲缘关系和进化程度。苹果属植物的起源与进化研究是许多学者和育种专家研究的重点。Dunemann等(1994)通过RAPD指纹图谱分析为栽培苹果起源于普通苹果和森林苹果的观点提供了新证据。亲本的确立可以为育种者选配育种亲本提供有用的信息。由于许多果树栽培品种最初从实生苗而来,父母本不清，DNA分子标记为亲本的确立提供了一个有效的手段。Harada(1993)根据RAPD分析认为,乔纳金(金冠×红玉)和陆奥(金冠×印度)这两个三倍体苹果品种其减数分裂的2N配子是由金冠提供的,这一结果与以前的同工酶分析结果一致。“津轻”苹果的父本因当时记载不详一直不得而知,结合RFLP和RAPD分析结果确认其父本为“红玉”。

1.2.2.3 品种鉴定和分类

1.2.2.3.1指纹图谱的绘制和品种鉴定

果树为多年生作物，多采用无性系繁殖，新老品种数量繁多，个体差异不甚明显，加之各地交流频繁，造成同物异名、同名异物现象普遍。传统的鉴别方法分辨率不高，分子指纹图谱是通过对供试材料的DNA指纹图谱进行比较分析，筛选出特异带，依此为鉴定该种质材料的客观依据，可高效、准确地建立指纹图谱、鉴别品种。同时高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。各种分子标记均可用于指纹图谱分析，建立苹果指纹图谱，并且对苹果的某些品种或砧木进行鉴定。祝军等（2000）以OPJ03为引物，构建了28个苹果品种的RAPD指纹图谱，区分了其中的15个品种，区分率达53.6％；周爱琴等以筛选出的OPJ03为引物，绘制了19个苹果砧木基因型的DNA指纹图谱，区分了其中的17个，区分率为95％。祝军等（2000）在建立苹果品种AFLP分析体系的基础上, 从68对引物中筛选出了4对多态性高、分辨能力强的引物(即P₃₂M₄₆、P₄₄M₅₃、P₅₉M₄₁和P₇₉M₆₁)。分析了P₃₂M₄₆引物绘制的我国25个苹果重要品种的AFLP指纹图谱的遗传多样性, 确定了各供试品种的差异带,区分了供试的25个苹果品种。宣继萍等（2002）应用ISSR技术构建了7个苹果栽培品种的ISSR指纹图谱。

1.2.2.3.2 系谱分析和分类

鉴别植物的遗传特性，进而进行分类在实际育种及遗传研究中极为重要，最简单的分类方法是根据叶片及枝条的形态特征进行分类，而这种分类方法大多依据分类者的经验，缺乏客观性及准确性；形态特征的多变量分析，同工酶分析方法较形态学有了较大的进步，但是这些方法不仅缺乏客观性及准确性，而且在分类方法上也存在着很多制约点。DNA分子标记的出现，克服了以上的缺点和不足，建立在分子水平上的苹果分类体系，提高了分类的准确性。Harada等（1993）对苹果品种津轻RAPD分析，并结合RFLP分析，确认其父本正是红玉。而乔纳金（金冠×红玉）和陆奥（金冠×印度）是两个三倍体苹果品种，通过RAPD分析，比较扩增谱带，认为提供二倍体配子的均是母本品种金冠。王爱德等（2005）利用SSR的方法对苹果25个栽培品种进行了基因组多态性分析，将供试的苹果品种分为4个类群，与传统系谱基本一致。

1.2.2.4 分子标记遗传图谱的构建

遗传图谱就是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得的基因标记或其它遗传标记在染色体上的相对位置的排列图。在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能。分子遗传图谱的构建是根据多态性DNA片段对分离群体的直接观察统计而实现的。与传统的遗传图谱相比，分子图谱位点多，构建速度快，效率高，且不受发育阶段及环境条件的影响。随着DNA分子标记技术的发展，标记的种类越来越多，密度越来越高。高密度的遗传图谱可为育种工作提供关于某个物种完整而详细的资料，使育种工作者可以很方便地找到与要研究的所连锁的分子标记，并可把在遗传育种中发现的新标记定位于分子遗传图谱。此外，高密度的遗传图谱可为种质资源的保存和基因资源搜索的量化提供科学依据。构建遗传连锁图通常采用F₂或BC₁群体,但由于果树基因组高度杂合,且多自交不亲合,很难获得纯系。

为此,Hemmat提出双假测交的理论,即认为杂交的双亲均为高度杂合的个体,一个亲本的许多杂合位点在另一个亲本中表现隐性纯合或亦为杂合位点, 这些位点在F1代的分离比例为1∶1或3∶1,从而使得利用F1分离群体对双亲进行遗传分析和作图成为可能。1989年由7个国家合作发起的“欧洲苹果基因组计划”,已取得重大进展。Hemmat等（1994年）利用Rome Beauty×White Angle杂交F1代群体发表了第一张苹果遗传连锁图,其中White Angle的连锁图包括253个标记,分布在24个连锁群上；Rome的连锁图包含21个连锁群、156个标记,两个连锁图中有14个连锁群表现出同源性。但由于这一连锁图上大部分是RAPD标记,很难在其它实生群体上应用。Maliepaard等（1998）利用Prima×Fiesta产生的152株种苗作为试材在前人基础上构建了一份苹果连锁图(欧洲苹果基因组计划图谱),此图谱成为以后几年苹果基因组研究的重要参考资料,含17个连锁图,对应苹果的17条同源染色体,Prima的连锁群平均长度50cM,Fiesta的连锁群平均长度为58cM,比一般的农作物(100～150cM)小得多,包含200多个标记(30多个RAPD,24个同工酶，124个RFLP,10个SSR,9个AFLP标记和1个SCAR标记)。该图谱含有大量的可转移的共显性标记，是苹果基因研究的一张核心图谱。Liebhard等(2003)在前人研究的基础上以Fiesta×Discovery群体构建了目前最完整、饱和度最大的苹果遗传连锁图谱，其中大量的共显性标记，如SSR，使该图谱可以快速转移到其他品种或物种，利用它能分析检测不同遗传背景的数量性状位点。该图谱包含840个标记（475个AFLPs，235个RAPDs，129个SSRs和1个SCAR个分子标记），与以前的遗传图谱相比总共增加了511个新的AFLP、SSR、RAPD和SCAR标记,其中98个SSR标记出现在两个亲本的连锁图上；Fiesta和Discovery连锁图分别长1143.8cM和1454.6cM,染色体长度平均分别为67.3cM和85.6cM。

目前所建立的几张苹果遗传连锁图谱标记密度不均匀，染色体着丝粒区的标记密度明显大于端粒附近的区域，因此增加可转移性标记数量，使标记均匀覆盖整个染色体是以后苹果连锁图谱建立的目标之一。

1.2.2.5 基因标记、定位和克隆

基因标记就是筛选与目的基因紧密连锁的遗传标记，是基因定位克隆和分子辅助选择育种的前提。基因定位就是将遗传标记确定在染色体上的位置。分子标记可以迅速寻找样品DNA分子间多态性差异,进而得到与此差异区相连锁的标记,从而将目标基因定位在这一区域内。目前寻找与目的基因紧密连锁的分子标记有效的方法有3种：（1）连锁图法；（2）近等位基因系法(NIL)；（3）集群分离分析法(BSA)。近等位基因系是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的两个群体。近等位基因系是通过不平衡杂交获得的。由于果树是多年生作物，杂合程度高，童期长，近等位基因系的构建十分困难，所以在苹果上也是很难获得的。并且由于大多数果树没有遗传连锁图或是连锁图饱和度低,应用价值不大,以及果树上构建近等位基因系难度大,使得BSA法成为标记果树重要农艺性状基因的主要方法。BSA法将分离群体中研究的目标性状根据其类型分为两组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成两个基因池，这两个基因池除在目标性状上有差异外，其余遗传背景均相同（Nandi,1997）。BSA法的提出成为快速鉴别特定基因或染色体区域相连锁标记的有效方法，其可行性已被大量实验证明（Miftahudin等，2002）。Tartarin（1998年）用RAPD和BSA法标记了苹果抗黑星病基因(Vf)。目前已有相当一批控制果树重要农艺性状的质量、数量性状基因被标记。如苹果的柱型基因、果色基因、抗白粉病基因、果树矮化基因等。Hemmat等（1997）发现了与苹果柱型基因Co相连锁的SSR标记。王彩虹等（2001）对与苹果柱型基因紧密连锁的分析标记进行了筛选；田义轲等（2003）进行了一个与苹果柱型基因（Co）连锁的RAPD标记的研究。之后，他们（2005）又对Co进行了SSR标记定位。赵静等（2006）对与苹果果皮红色性状相关的RAPD标记进行了筛选。

另外，遗传标记的一个重要用途就是克隆基因。利用已有的连锁图进行标记，一旦发现某一基因被定位在某一染色体上，就可以选择分散在染色体上不同位点上的标记，通过染色体步移法(Chromosome walking)或染色体登陆(Chromosome landing)等方法，获得含该性状基因的阳性克隆，通过筛选cDNA文库得到该基因。研究基因的克隆、鉴定及特征，有助于了解控制果树果实大小和味道的机制，并且在有关果实生长及酸度差异表达的基因定位于分子连锁图上之后，可作为分子辅助育种的分子标记。

1.2.3 SSR标记与其他分子标记比较分析

1.2.4 结语

随着分子生物学技术的发展，新的分子标记还会不断地出现，21世纪是生物技术时代，DNA分子标记技术必将在苹果种质资源及遗传育种研究上取得更大的进步，使种质资源的研究、分子遗传图谱的构建日趋成熟，使遗传群体、基因标记以及基因文库得到充分应用，绝大多数农艺性状基因得到准确定位，并利用图位克隆技术克隆重要的性状基因，实现分子标记的自动化。