1.3 本研究的目的和意义
苹果属种质资源丰富，品种类型复杂多样。中国是世界上最大的起源中心之一，现有世界上苹果属种质资源中的多数类型，各类野生种和栽培种十分丰富，在研究苹果属种质资源的起源演化、亲缘关系以及遗传多样性等方面居重要的地位。在长期的演化过程中，有部分种演化成栽培类型、用作砧木或遭到人为的破坏而濒临灭绝。而且，树体基因型高度杂合，种质类型或品种之间的遗传关系、演化过程等许多理论问题利用传统的分析验证方法尚未得到解决。利用新兴的分子生物学的方法研究苹果属种质资源的起源、亲缘关系、分类以及遗传多样性对苹果属种质资源的保存、苹果种质的开发、充分利用其自然杂交种和栽培驯化形成的变种和品种具有重要的意义。
SSR简单序列重复，亦称微卫星DNA是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记，遵循孟德尔共显性遗传方式。苹果中大量的SSR标记已经报道，这对苹果品种间遗传图谱的排列和转移非常有用；由于在苹果基因组中存在大量的SSR等位基因，所以有很高几率发现大多数品种间的多态性（Gianfranceschi等，1998；Liebhard等，2002）。Liebhard等（2002）又发展和确定了苹果的140个新的SSR位点。因SSR具有的共显性标记、物种特异性、高度多态性、共享标记引物和重复性好等优点，已被应用于苹果种质资源研究的许多方面（Hokanson等，2001；Luis Goulao等，2001；Liebhard等，2003；Gygax等，2004；姚玉新等，2004；Paul等，2005）。但是，在苹果属种质资源亲缘关系和遗传多样性等方面研究较少。
本研究的目的在于优化适宜于苹果属种质资源的SSR技术体系，建立59份苹果属种质资源的SSR指纹图谱，并以此为基础，对分属于19个种的59份苹果属种质资源中的17份栽培品种、10份新疆的野生苹果、13份地方品种和19份野生苹果资源SSR位点的遗传多样性进行研究。通过SSR位点的聚类分析探讨所研究的野生种、新疆的野生苹果和地方品种的遗传背景和亲缘关系，从分子水平研究苹果属植物的遗传分类，同时对以往从形态学、细胞学、孢粉学、同工酶等方面研究苹果亲缘演化关系的结果和已知苹果属种质资源的系谱进行验证，为苹果属植物新的分类系统提供分子水平的证据。
第二章 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 植物材料
供试的59份苹果属种质资源材料均取自中国农业科学院果树研究所国家苹果种质资源圃（兴城），包括17份栽培品种、10份新疆的野生苹果、13份地方品种和19份野生种或其变种。59份材料分属于苹果属的19个种，它们依次是苹果、新疆野苹果、中国苹果、楸子、花红、大鲜果、山荆子、湖北海棠、褐海棠、三叶海棠、变叶海棠、扁楞海棠、朱眉海棠、陇东海棠、锡金海棠、西府海棠、垂丝海棠、毛山荆子、丽江山荆子。材料编号、名称、学名、原产地或亲本见表2.1。
表2.1 供试苹果属种质资源材料
Table 2.1 Malus germplasm resources for SSR analysis
编号
code
|
材料名称
Material name
|
学名
Book name
|
原产地和/或亲本
parentage and / or Origin
|
1
|
黄魁Yellow Transparent
|
M.domestica Borkh.
|
俄罗斯Russia,亲本不详 Unknown parentage
|
2
|
贝拉Vista Bella
|
M.domestica Borkh.
|
美国America，77349×乔纳红77349×Jonared
|
3
|
津轻Tsugaru
|
M.domestica Borkh.
|
日本Japan，金冠×不详GoldenDeli×Unknown
|
4
|
君袖Northern Spy. Spy
|
M.domestica Borkh.
|
美国America，偶然实生Occurrent seedling
|
5
|
旭McIntosh.
|
M.domestica Borkh.
|
加拿大Canada,偶然实生Occurrent seedling
|
6
|
金冠Gold Delicious
|
M.domestica Borkh.
|
美国America,偶然实生Occurrent seedling
|
7
|
元帅Delicious
|
M.domestica Borkh.
|
美国America,偶然实生Occurrent seedling
|
8
|
嘎拉Gala
|
M.domestica Borkh.
|
新西兰New Zealand,（元帅×橘苹)×金冠Kidd’s Orange Red×Golden Deli
|
9
|
祥玉Winter Banana
|
M.domestica Borkh.
|
美国America,偶然实生Occurrent seedling
|
10
|
红玉Jonathan.
|
M.domestica Borkh.
|
美国America,可口香实生Esopus Spitzenburg seedling
|
11
|
乔纳金Jonagold
|
M.domestica Borkh.
|
美国America，金冠×红玉Golden Deli×Jonathan
|
12
|
倭锦Ben Davis
|
M.domestica Borkh.
|
不详Unknown，不详Unknown
|
13
|
紫香蕉Black Gilliflower
|
M.domestica Borkh.
|
不详Unknown，不详Unknown
|
14
|
澳洲青苹Granny Smith
|
M.domestica Borkh.
|
澳大利亚Australia，不详Unknown
|
15
|
东光Toko
|
M.domestica Borkh.
|
日本Japan，金冠×印度Golden Deli×Indo
|
16
|
国光Ralls
|
M.domestica Borkh.
|
不详Unknown，不详Unknown
|
17
|
富士Fuji
|
M.domestica Borkh.
|
日本Japan，国光×元帅Ralls×Delicious
|
18
|
新疆野苹果Xinjiangyepingguo
|
Malus sieversii (Ledeb.) Roemer.
|
中国新疆 Xinjiang,China
|
19
|
新疆红肉Xinjianghongroupingguo
|
f.neidzwetzkyana(Dieck)
|
中国新疆Xinjiang,China
|
20
|
克孜阿尔玛Keziaerma
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
21
|
冬白果Dongbaiguo
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
22
|
阿留斯坦Aliusitan
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
23
|
中熟红果子Zhongshouhongguozi
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
24
|
吉尔吉斯苹果Jierjisipingguo
|
M.sieversii (Ledeb.) Roemer.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
25
|
柠檬海棠Ningmenghaitang
|
M.prunifolia (Willd.) Borkh.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
26
|
霍城白果子Huochengbaiguozi
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
27
|
白海棠Baihaitang
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国河北Hebei,China
|
28
|
矮花红Aihuahong
|
var.nana Li Y N.
|
中国西北 Northwest of China
|
29
|
大香果Daxiangguo
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国河北Hebei,China
|
30
|
牛妈妈海棠Niumamahaitang
|
M.prunifolia (Willd.) Borkh.
|
中国河北Hebei,China
|
31
|
楸子Qiuzi
|
M.prunifolia(Willd.)Borkh.
|
中国China
|
32
|
绵苹果Mianpingguo
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国China
|
33
|
中国彩苹Zhongguocaiping
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国China
|
34
|
黄甜果Huangtianguo
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国China
|
35
|
香果Xiangguo
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国西北Northwest of China
|
36
|
金沙依拉姆Jinshayilamu
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国新疆Xinjiang,China
|
37
|
崂山奈子Laoshannaizi
|
M.domestica subsp.chinensis Li.
|
中国山东Shandong,China
|
38
|
花红Huahong
|
M.asiatica Nakai.
|
中国西北Northwest of China
|
39
|
大鲜果Daxianguo
|
M.soulardii Britton.
|
北美North America
|
40
|
槟子Binzi
|
M.domestica ssp. chinensis var binzi Li Y.N.
|
中国China
|
41
|
扎矮山荆子Zhaaishanjingzi
|
M.baccata (Linn.)Borkh.
|
中国内蒙古扎兰屯Zhalantun in Inner Mongolia of China
|
42
|
平邑甜茶Pingyitiancha
|
M.hupehensis (Pamp.)Rehd.
|
中国山东平邑Pingyi in Shandong of China
|
43
|
褐海棠Hehaitang
|
M.fusca (Raf.) Schneid.
|
北美North America
|
44
|
卢氏三叶海棠Lushisanyehaitang
|
M.sieboldii (Regel.) Rehd.
|
中国江西Jiangxi,China
|
45
|
山荆子Shanjingzi
|
M.baccata(L.)Borkh
|
中国东北Northeast of China
|
46
|
兴山湖北海棠Xingshanhubeihaitang
|
M.hupehensis (Pamp.) Rehd.
|
中国湖北Hubei,China
|
47
|
维西三叶Weixisanye
|
M.sieboldii (Regel.)Rehd.
|
中国云南Yunnan,China
|
48
|
雅江变叶海棠Yajingbianyehaitang
|
M.toringoides (Rehd.)Hughes.
|
中国四川Sichuan,China
|
49
|
小金变叶Xiaojinbianye
|
M.toringoides (Rehd.)Hughes.
|
中国四川Sichuan,China
|
50
|
吉林小黄海棠Jilinxiaohuanghaitang
|
M.prunifolia (Willd.)Borkh.
|
中国吉林Jilin,China
|
51
|
八棱海棠Balenghaitang
|
M.robusta (Carr.) Rehd.
|
中国河北Hebei,China
|
52
|
朱眉海棠Zhumeihaitang
|
M.zumi (Mats.) Rehd.
|
日本Japan
|
53
|
陇东海棠Longdonghaitang
|
M.kansuensis(Batal.) Schneid.
|
中国湖北Hubei,China
|
54
|
林芝海棠Linzhihaitang
|
M.sikkimensis (Wenzig)Koehne.
|
中国西藏 Tibet,China
|
55
|
德钦海棠Deqinhaitang
|
M.sikkimensis(Wenzig) Koehne. .
|
中国云南Yunnan,China
|
56
|
西府海棠Xifuhaitang
|
M.micromalus Makino.
|
中国江西Jiangxi,China
|
57
|
垂丝海棠Chuisihaitang
|
M.halliana Koehne.
|
中国江苏Jiangsu,China
|
58
|
毛山荆子Maoshanjingzi
|
M.manshurica(Maxim.) Komarov
|
中国东北Northeast of China
|
59
|
丽江山荆子Lijiangshanjingzi
|
M.rockii Schneid.
|
中国云南Yunnan,China
|
注：1～17为栽培品种，18～26为新疆的野苹果，27～40为地方品种，41～59为野生种或野生种的变种。
Note: 1~17 are cultivars,18~26 are wild apple species in Xinjiang province, 27~38 and 40 are regional species , 41~59 are wild apple species or their variation.
2.1.2 供试试剂及配制
2.1.2.1 主要药品和试剂
CTAB、PVP、β－巯基乙醇、去离子化甲酰胺、二甲苯青FF、溴化乙锭、TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)、丙烯酰胺、尿素、矿物油购自美国Amersco公司；过硫酸铵（APS）、甲叉双丙烯酰胺购自英国BBI公司；EDTA2Na购自AKZO公司；λDNA/HindⅢ、Taq DNA Polymerase、pBR322 DNA/MSPⅠMarkers购自北京华美生物工程公司；Tris-碱、琼脂糖、亲和硅烷、剥离硅烷、硝酸银购自北京鼎国生物有限公司；硼酸、冰醋酸、溴酚蓝、蔗糖、无水碳酸钠、甲醛、硫代硫酸钠氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯仿、异戊醇、无水乙醇和95％乙醇均购自葫芦岛市器化玻经贸有限公司。
2.1.2.2 试剂的配制
用于本试验的主要试剂配制方法如下：
（1）5 M NaCl
称取73.0 g NaCl固体，加入蒸馏水，在磁力搅拌器上加热搅拌，等到溶解后，冷却至室温，定容至250 mL，高压灭菌，备用。
（2）0.5 M EDTA（pH 8.0）
称取46.53 g EDTA2Na，加到200 mL蒸馏水中，并于磁力搅拌器上剧烈搅拌，待溶解之后，用NaOH颗粒调节溶液的pH至8.0，然后将溶液定容至250 mL，高压灭菌，备用。
（3）1 M Tris-HCl（pH 8.0）
称取Tris碱30.48g，溶于185ml蒸馏水中，加入浓盐酸（36％）调节pH值至8.0（根据经验，所需要的体积大约为8.5ml），高压灭菌，备用。
（4）1×TE
用移液器量取2 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和400 μL 0.5 M EDTA（pH 8.0），加入蒸馏水，定容至200 mL，高压灭菌，备用。
（5）CTAB提取缓冲液
称取5 g CTAB粉末，5 gPVP粉末，放入含有25 mL 1 M Tris-HCl、10 mL 0.5 M EDTA、70 mL 5 M NaCl的溶液中，加入蒸馏水，完全溶解后，将溶液定容至250 mL，高压灭菌，备用。
（6）3 M 醋酸钠（pH5.2或pH7.0）
称取24.6g 无水NaAc，溶于80mL蒸馏水中，完全溶解后，用冰醋酸将溶液的调节pH至5.2或用稀乙酸调节pH至7.0，最后定容至100 mL，再测pH，高压灭菌，备用。
（7）溴酚蓝蔗糖溶液
称取0.25g溴酚蓝、40g蔗糖溶于80ml蒸馏水中，待充分溶解后定容至100ml，备用。
（8）10 mg/mL EB
在通风柜中，将0.5 g EB倒入50 mL蒸馏水中，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，放入棕色瓶中，并在通风柜中保存备用。
（9）10％APS
称取0.1 g APS，倒入1.5 mL 离心管中，然后加入1 mL 纯水，颠倒几次至完全溶解，在4 ℃冰箱中保存。
（10）10mg/ml Na2S2O3
称取1g Na2S2O3 加入80ml蒸馏水至完全溶解，定容至100ml。
（11）50×TAE（贮存液）
称取242gTris，加入57.1mL冰醋酸、100mL 0.5M EDTA（pH 8.0）和适量蒸馏水，搅拌至完全溶解后，定容至1000 mL，在4 ℃冰箱中保存。电泳时，稀释至1×使用。
（12）10×TBE（贮存液）
称取108gTris碱、3.7gEDTA和54g硼酸，加入800ml蒸馏水至完全溶解后，定容至1000ml，在4 ℃冰箱中保存。电泳时，稀释至1×使用。
（13）甲酰胺上样缓冲液
称取50mg溴酚蓝和50mg二甲苯青FF，加入到含有1ml 0.5M EDTA和40ml 80%(m/v)的去离子化甲酰胺中，待充分溶解后，用蒸馏水定容至50ml，在4 ℃冰箱中保存。
（14）6％聚丙烯酰胺原胶液
称取210.22g尿素、28.5g丙稀酰胺和1.5g甲叉双丙稀酰胺，并量取25ml 10×TBE缓冲液于烧杯中，加水至400ml，充分搅拌使其完全溶解，后定容至500ml，在4 ℃冰箱中保存。
|
Yüklə 2.72 Mb.