Svensk Förening för Patologi – Svensk Förening för Klinisk Cytologi

Appendix 3. Histologiska storsnitt i rutin bröstdiagnostik

I den nuvarande mammografiska eran upptäcks flera makroskopiskt osynliga förändringar. Tumörerna är ofta små, ofta in situ och ofta multifokala med betydande intratumoral heterogenitet. Under dessa omständigheter är den traditionella histologiska bearbetningen av bröstpreparat (sampling av makroskopiskt synliga förändringar och registrering av makroskopiska mått) bristande; storsnittstekniken är ett effektivare alternativ. Användandet av megakasetter (supermegakasetter, standard mått på objektglas 75 x 55 mm) är ett stor steg i rätt riktning; standardiserade storsnitt (objektglas 120 x 90 mm) är ännu effektivare. Målet är att avbilda tvärsnitt av hela preparatet i det mest representativa nivån eller i flera representativa nivåer och komplettera eller ersätta den makroskopiska bedömningen med ”subgross” och med mikroskopisk bedömning.

1. 
   Sjukdomens utbredning (”extent” of the disease” eller ”whole tumor measurement”)
   

Se definition i KVAST dokumentet.

2. 
   Sjukdomens distribution (unifokal, multifokal eller diffus, eller multicentrisk) skall analyseras separat för den invasiva och in situ komponenten och anges sammanfattande.
   

Se definitioner i KVAST dokumentet.

3. 
   Invasiva tumörens storlek:
   

Mätning av tumörstorlek är komplex uppgift. Man bör notera tumörens största makroskopiska dimension på tvärsnitten av preparatet (bäst om ofixerad), avbilda denna dimension histologiskt (genom att bädda skivan med största tumördimension i sin helhet) och sen jämföra histologiska måttet med motsvarande makroskopiska och radiologiska mått. Modern radiologi ger oftast korrekt information om tumörens storlek, som bör vara vägledande vid histologisk analys. Det är däremot den histologiska tumörstorleken som ska registreras. Sfäriska/ovala tumörer mäts lätt, men spikulerade/stjärnformiga tumörer kan ha långa utskott innehållande invasiva strukturer. I de sistnämnda korrelerar radiologiska måtten bäst med histologisk storlek av tumörkroppen utan inkluderade utskott. Betydande avvikelser från radiologiska mått bör diskuteras på kliniska ronder.

4. Intratumoral och intertumoral heterogenitet ska också avbildas och noteras.

Storsnittet är den bästa möjligheten för mammografisk - patologisk jämförelse. Storsnittsglas kan projekteras som overhead och direkt korreleras med fynd på mammogram, preparatröntgen, ultraljudsbild och inte minst MR bild. Användandet av projekterade storsnitt på kliniska ronder ger bättre feedback till radiologer och kirurger jämfört med demonstration av mikroskopiska fynd. Kostnader knutna till användning av storsnittsteknik i rutindiagnostik har också studerats; avbildning av en representativ tvärskiva av preparatet sker billigare med storsnittsteknik än med konventionell histologi.

correlation utilizing large format histology for malignant breast diseases. Semin Breast

Dis 8:152-162

Boyages J, Jayashinghe UW, Coombs N (2010) Multifocal breast cancer and survival:

each focus does matter particularly for larger tumors. Eur J Cancer 46(11):1990-1996

Egan RI (1982) Multicentric breast carcinomas: clinical – radiographic-pathologic whole

organ studies and 10-year survival. Cancer 49:1123-1130

Faverly DRG, Henricks JHCL, Holland R (2001) Breast carcinoma of limited extent.

Frequency, radiologic – pathologic characteristics, and surgical margin requirements.

Cancer 91: 647-659

Fochsini MP, Tot T, Eusebi V (2002) Large section (macrosection) histologic slides. In

Silverstein MJ. ed. Ductal Carcinoma in situ of the Breast, 2nd ed. Lippincott, Williams

and Wilkins, Philadelphia, pp. 249 – 254

Holland R, Veling SH, Mravunac M, Hendriks JH (1985) Histologic multifocality of Tis,

T1-2 breast carcinomas. Cancer 56:979-990

Holland R, Hendricks JH, Vebeek AL, Mravunac M, Schuurman S, Stekhoven JH (1990)

Extent, distribution, and mammographic/histological correlation of breast ductal carcinoma

in situ. Lancet 335(8688):519-522

Jackson PA, Merchant W, McCormick CJ, Cook MG (1994) A comparison of large block

macrosectioning and conventional techniques in breast pathology. Virchows Arch

425:243-248

Mechine-Neuville A, Chenard MP, Gairard B, Mathelin C, Bellocq JP (2000) Large sections

in routine breast pathology. A technique adapted to conservative surgery Ann Pathol

20(3):275-209

Tot T (2003) The diffuse type of invasive lobular carcinoma of the breast: morphology and

prognosis. Virchows Arch 443:718-724

Tot T (2005) DCIS, cytokeratins and the theory of the sick lobe. Virchows Arch 447:1-8

Tot T (2007) The clinical relevance of the distribution of the lesions in 500 consecutive

breast cancer cases documented in large-format histological sections. Cancer 110:2551-

2560

versus tumors of limited extent. Hum Pathol 40:199-205

Tot T, Gere M (2008) Radiological – pathological correlation in diagnosing breast

carcinoma: the role of pathology in the multimodality era. Pathol Oncol Res 14(2):173-

178

Tot T, Tabár L, Dean PB (2002) Practical Breast Pathology. Springer, Stuttgart – New,

Tot T (2010) Cost-benefit analysis of using large-format histology sections in routine

diagnostic breast care. The Breast 19(4): 284-88

Weissenbacher TM, Zschage M, Janni W, Jeschke U, Dimpfl T, Mayr D, Rack B,

Schindlbeck C, Friese K, Dian D (2010) Multicentric and multifocal versus unifocal

breast cancer: is the tumor-node-metastasis classification justified? Breast Cancer

Res Treat 122(1):27-34, 2010

Appendix 4. Biomarkör analyser
Biomarkörer analyseras på tumörvävnad med kontrollerad och om möjligt dokumenterad fixeringstid på 24-72 timmar. Kall ischemitid (tiden det tar från att preparatet har tagits från patienten tills det kommer i formalin) anges om möjligt. En tumörbit som läggs i kassett i formalin kan med fördel tas redan från det färska bröstpreparatet. Analyserna skall vara kvalitetssäkrade (intern kvalitetssäkring, extern kvalitetssäkring (testnivå ex NordiQC eller UK-nequas och populationsnivå ex SweQA/Equalis)). Primär bröstcancer och behandlings- krävande recidiv skall analyseras avseende östrogen- och progesteron receptorer, proliferationsmarkör och HER2 status på histopatologisk material. Det är viktigt att patologen informerar kliniker om vilka antikroppar, ISH prober och immunfärgmaskiner som användas samt om namn på leverantör. Med fördel kan kontroller, såväl negativa som olika positiva, finnas med på glaset.
Validering av analyserna och dokumentation skall utföras när testmetoden ändras, sålunda när det sker ändringar i fixeringsmedel och tid, dehydrering, förbehandling, använd antikropp eller probe och vid ändring i och byte av maskiner^1-3.
Östrogen- och progesteronreceptorstatus utförs med immunhistokemisk metod

Validering

En relevant standard är en test där de specifika preananlytiska och analytiska komponenter överensstämmer exakt med tests där resultatet har validerats mot klinisk effekt av endokrin terapi. För ER- och PgR positiva kategorin skall 90% vara överensstämmande och för den ER- och PgR negativa kategorin skall 95% vara överensstämmande.

Antikroppar som är klinisk validerade i litteraturen är ER klonerna 1D5, 6F11, SP1, och 1D5+ER.2.123 (cocktail). För PgR är det klonerna 1A6, 1294 och 312. FDA 510(k)-cleared ER/PgR kit kan också användas^2.
Kontroller

Vid den immunhistokemiska färgning användas externa kontroll såsom endometrievävnad eller vävnad från cervix/portio uteri eller cellinjer med graderad intensitet (0, 1-2+ 3+). Samtidig har man en intern kontroll med färgning av normalvävnad. Normala bröstkörtlar skall vara färgade med olika intensitet. Några, men inte alla luminala celler får vara starkt färgade. Stromaceller och myoepiteliala celler måste vara negativa.

Immunhistokemi avläses tillsammans med tillhörande HTX och/eller IHC glas för att lokalisera den invasiva cancer. Om så krävs så utförs immunhistokemisk färgning för myoepiteliala celler. In situ cancer skall inte avläsas, om inte så särskilt begärts.

Resultatet anges som helt negativt eller med uppskattat positiv procent avläst i den invasiva komponenten i hela snittet. I praktiken innebära detta att det man svarar enligt följande:

• 
  Uppskattat % positiva celler anges med 0, 1%, 5%, 10%, 20%..80%, 90%, 95% och 100%.
  

Brunfärgade kärnor bedöms som positiva oavsett färgintensitet. Det innebär, att man får använda högförstoring för att upptäcka en svag infärgning, som trots detta kan förekomma i en stor andel av cellkärnorna.

Vävnad där interna kontroller inte utfaller korrekt trots att testet har upprepats kan inte användas till receptorbestämning. Dessutom kan det uppstå problem vid grovnåls biopsier som har varit fixerat i alkohol eller andra fixativ än 10% neutral buffrad formalin, biopsier som har varit fixerade i <6 timmar eller >72 timmar och biopsier där kall ischemitid överstiger 1 timme. Urkalkat material som har legat i stark syra kan också ge resultat som inte kan evalueras.

• 
  Bedömningen utförs på invasiv cancer inom det (de) område(n) som har det högsta antalet Ki67-positiva cancercellskärnor/ytenhet (”hot spot”). Ett sådant område brukar omfatta minst 200 celler.
  
• 
  Vid minsta tvekan om vilka områden som utgörs av invasiv cancer skall immunhistokemisk färgning för myoepiteliala celler (ex p63, SMMS1) göras.
  
• 
  I vissa fall (ex riklig lymfocytinfiltration, kraftig stromareaktion) kan dubbelfärgning för Ki67 och cytokeratin underlätta bedömningen.
  
• 
  Bedömningen utförs med x40 objektiv.
  
• 
  Räkna index på 200 celler med 10 celler i taget. Detta kan normalt göras i 1-2 synfält.
  
• 
  Som positiva celler räknas alla kärnor färgat för DAB (brun) och hematoxylinfärgade (blå) kärnor räknas som negativa^4.
  
• 
  Index anges med så exakt siffra som möjligt; ingen intervallbedömning.
  

Se Ki67 gränsfall bilden på hemsidan.

Det rekommenderas att för att utföra HER2 testning bör laboratoriet visa 95% överensstämmelse med ett annat validerat test för positiva och negativa värden. Det är viktigt att alla nya tester blir jämförda med ett referenstest där det föreligger en klinisk validering, vilket betyder att referenstestet kan förutsäga kliniskt resultat^{1, 5}.

Vid immunhistokemisk färgning används extern kontroll. Med fördel kan bröstcancervävnad med varierande uttryck av HER2 protein användas (fall med 0, 1+, 2+ och 3+ där in situ hybridisering (ISH) tidigare har utförts) som kontroll. Dessutom kan cell linjer med varierande utryck användas. Samtidig används intern kontroll där det i normal bröstvävnad skall ses en svag, ej komplett infärgning i utförsgångar.

Om cytoplasmatisk färgning döljer membranfärgningen måste testet göras om eller ISH utföras.

Vid ISH test kan extern kontroll användas med normal, tveksamt och amplifierat HER2 utryck. Om inte kontrollerna utfaller som väntat måste testet göras om.

HER2 IHC avläsas med 10x objektivet. Vid bedömning granskas hela snittet och skärningspunkten på 10% bedömmas av alla invasiva tumörceller.

Immunhistokemi för HER2 och ISH bör avläsas tillsammans med tillhörande HTX och/eller IHC glas för att lokalisera den invasiva cancern. Om nödvändigt utförs immunhistokemisk färgning för myoepiteliala celler. In situ cancer skall inte avläsas.
HER2 kan bestämmas som proteinuttryck i membranet med immmunhistokemi (IHC) och/eller med gen amplifikation status med in situ hybridisering (ISH). Båda metoderna kan användas till bestämning av patientens HER2 status. Båda testen har sina diagnostiska problem som bör observeras. Beroende på materialet och sampling kan den ena testet föredras framför det andra. Patologen som har ansvar för histologin bör bestämma den optimala test typen, men fortfarande skall alla IHC 2+ och 3+ undersökas med ISH.
IHC

0: Ingen in färgning eller inkomplett membranfärgning som är svag/nästen inte synlig i ≤10%

U-format basolateral kraftig positiv membranfärgning där den luninala del av membranen är negativ (sällsynta fall)^6

Komplett kraftig membranfärgning i ≤10%
3+: Komplett, kraftig membranfärgning i >10%
ISH

Vid bedömning granskas hela snittet och skärningspunkten på 10% bedömmas av hela snittet. HER2 IHC glaset kan användas till att bedöma vilka celler som skall räknas.

Om den amplifierade klon utgör >10% av hela snittet är fallet HER2 positivt. Uppskattat andel amplifierade celler anges i svaret.

Om resultatet ger positiv HER2 status anges uppskattat andel HER2 amplifierade celler i svaret.

Fall med <10% HER2 amplifierade celler är HER2 status negativa.
Rapportering

Vid rapportering av resultat rekommenderas en algoritm som definierar HER2 status utifrån positiva och negativa resultat för båda HER2 protein expression och HER2 gen amplifikation¹.

 

Positivt HER2 status

IHC färgning med 3+ eller 2+ med kvot ≥2 och/eller antal HER2 kopior ≥4
Negativt HER2 status

IHC färgning med 0, 1+ eller 2+ av cellmembran protein expression och

ISH resultat med en ISH kvot <2,0.
I svaret anges

HER2 IHC: 0, 1+, 2+, 3+, ej utfört, bedömning ej möjlig

HER2 status: positiv, negativ, ej utfört, bedömning ej möjlig

Om kvoten ligger nära 2 eller antal kopior av HER2 ligger nära 4 skall det anges i svaret.
Inte evaluerbara tests

Vävnad där interna kontroller inte utfaller korrekt trots att testet har upprepats och som är undersökt med båda IHC och ISH kan inte användas till HER2 testning. Urkalkat material måsta alltid undersökas med ISH om det finns DNA kvar.

Partiell mastektomi med invasiv bröstcancer

Nerfryst tumörvävnad?

Data sparad i kvalitetsregistret?

Mått, cm:

Tuschning av marginaler

Sidoresektionsyta gul från mynt/klips 1 till kl.

Sidoresektionsyta blå från mynt/klips 1 till kl.

Storsnittsteknik använt?

Tumörplacering, kl:

Histologisk diagnos:

Antal invasiva tumörer i bröstet:

Multifokalitet (flera invasiva cancern med benign bröstvävnad/in situ vävnad mellan):

Mikroskopisk storlek av största invasiva focus, mm:

Samlad storlek av alla in situ och invasiva foci (extent), mm:

Minsta avstånd till sidoresektionsyta från invasiv cancer, mm:

Minsta avstånd till sidoresektionsyta från duktal cancer in situ, mm:
Kärlinväxt:

Histologisk grad (NHG):

Tubuli:

Pleomorfi:

Östrogen receptor, %:

Progesteron receptor, %:

HER2 protein:

ISH HER2:

Ki67 index,%:

Partiell mastektomi:

Sida:

Histologisk diagnos:

Histologisk grad (NHG):

Östrogen receptor, %:

Progesteron receptor, %:

HER2 protein:

ISH HER2:

Ki67 index, %:

Mastektomi med invasiv bröstcancer

Nerfryst tumörvävnad?

Data sparad i kvalitetsregistret?

Mått, cm:

Storsnittsteknik använt?
Sida:

Tumörplacering, kl:

Histologisk diagnos:

Antal invasiva tumörer i bröstet:

Multifokalitet (flera invasiva cancern med benign bröstvävnad/in situ vävnad mellan):

Mikroskopisk storlek av största invasiva focus, mm:

Samlad storlek av alla in situ och invasiva foci (extent), mm:

Minsta avstånd till sidoresektionsyta från invasiv cancer, mm:

Minsta avstånd till sidoresektionsyta från duktal cancer in situ, mm:
Kärlinväxt:

Histologisk grad (NHG):

Tubuli:

Pleomorfi:

Östrogen receptor, %:

Progesteron receptor, %:

HER2 protein:

ISH HER2:

Ki67 index,%:

Sida:

Tumörstorlek, invasiva komponenten, mm:

Histologisk grad (NHG):

Östrogen receptor, %:

Progesteron receptor, %:

HER2 protein:

FISH-analys HER2:

Ki67 index, %:

Partiell mastektomi med in situ cancer
Partiell mastektomi

Data sparad i kvalitetsregistret?

Mått, cm:

Tuschning av marginaler

Sidoresektionsyta gul från mynt/klips 1 till kl.

Sidoresektionsyta blå från mynt/klips 1 till kl.

Storsnittsteknik använt?
Sida:

Tumörplacering, kl:

Histologisk typ:

Multifokalitet (flera in situ foci med benign bröstvävnad mellan):

Mikroskopisk storlek av största in situ cancer focus, mm:

Samlad storlek av alla in situ foci (extent), mm:

Kärngrad:

Nekros:

Partiell mastektomi:

Sida:

Histologisk typ:

Kärngrad:

Nekros:
Mastektomi med in situ cancer
Mastektomi

Data sparad i kvalitetsregistret?

Mått, cm:

Storsnittsteknik använt?

Tumörplacering, kl:

Histologisk typ:

Multifokalitet (flera in situ foci med benign vävnad mellan):

Mikroskopisk storlek av största in situ cancer focus, mm:

Samlad storlek av alla in situ foci (extent), mm:

Kärngrad:

Nekros:

Sida:

Mikroskopisk storlek av största in situ cancer focus, mm:

Kärngrad:

Nekros:

Data sparad i kvalitetsregistret?

Sida:

Antal sentinel nodes:

Antal positiva sentinel nodes:

Storlek största metastasen, mm:

Immunhistokemi användt?

Antal sentinel nodes:

Antal positiva sentinel nodes:

____________________

Sida:

Antal non sentinel nodes med ITC:

Antal non positiva sentinel nodes:

Storlek största metastasen, mm:

Antal non sentinel nodes:

Antal non positiva sentinel nodes:

________________________

Sida:

Antal axill lymfkörtlar med ITC:

Antal positiva axill lymfkörtlar:

Storlek största metastasen, mm:

Sida:

Antal positiva axill lymfkörtlar:

________________________