Lycium barbarum увеличивает калорийность расходы и уменьшает окружность талии у здоровых полных мужчин и женщин: пилотное исследование

Реагенты и антитела

Все клеточные культуры расходные материалы и реагенты были приобретены у либо Corning Incorporated, Corning, NY) или Gibco (Carlsbad, CA). Антитела против фосфорилированного SMAD2 в Ser467, общее SMAD2, общее SMAD4, и β-актина были куплены от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Фосфорилированные SMAD4 в Thr277 антител был приобретен у Abnova (Тайбэй, Тайвань). Резистина антитело было заказать из Abcam (Кембридж, Великобритания). Антитела nitrotyrosine, фосфорилированные IRS-1 в Ser307, общее IRS-1, фосфорилированные GSK3α на Ser21, общее GSK3α, фосфорилированные p38 MAPK на Thr180/Tyr182, общее p38 MAPK, фосфорилированные JNK в Thr183/Tyr185, общее JNK, фосфорилированного ERK1/2 в Thr202/Tyr204, общее ERK1/2, IκBα, расщепляется каспазой-3, цитохром с, р62, beclin-1, Atg5, фосфорилированные mTOR в Ser2448, и общее mTOR были приобретены от клеточной сигнализации (Beverly, MA). Synaptophysin антител был куплен от DAKO (Glostrup, Дания).

Эксперименты на животных

Здоровых взрослых самок Sprague-Dawley (SD) у крыс с массой тела в диапазоне от 180-200 г, полученных из лабораторных животных на единицу (Лау), The University of Hong Kong. Крысы были сохранены и уход в соответствии с требованиями университета Гонконга и Национального института здоровья руководящих принципов. Все экспериментальные процедуры были проведены согласно протоколам, утвержденным комитетом использования животных для научных исследований и преподавания в университете Гонконга. Лабораторного животного единица гонконгский университет полностью аккредитован Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International).

Животные были разделены на шесть групп (n = 6 в каждой группе), а именно: (1) контрольная группа (крыс кормили очередная мышиная диета и водопроводной воде в течение 12 недель); (2) автомобиль-LBP группы (1 мг/кг LBP в 1 × PBS; устные желудочный зонд для кормления, один раз в сутки в течение всего экспериментального Продолжительность); (3) транспортного средства-лечебные LBP группы (1 мг/кг LBP в 1 × PBS; устные желудочный зонд для кормления, один раз в день из 9^ой недели до 12^ой неделю); (4) Нэш группы (крыс кормили высоким содержанием жиров в течение 12 недель); (5) Нэш + LBP группы (высокое содержание жира в рацион кормления с 1 мг/кг LBP в 1 × PBS; устные желудочный зонд для кормления, один раз в сутки в течение всего экспериментального Продолжительность); и (6), Нэш + терапевтический LBP группы (высокое содержание жира в рацион кормления с 1 мг/кг LBP в 1 × PBS; устные желудочный зонд для кормления, один раз в день из 9^ой недели до 12^ой неделю). Весь экспериментальный Продолжительность 12 недель. Открытая биопсия печени была выполнена на 8^ой неделю под внутрибрюшинного введения анестезии (Кетамин и Xylazine). Развитие НАСГ у крыс, включая рецепт и подготовка протоколов диеты, была осуществлена на основании ранее описанных добровольное кормление НАЖБП животной модели^15,16. Диета состоит из 9,3 г-Айн-93MX (Dyets регистрации, Bethlehem, PA), 2,6 г-Айн-93VX (Dyets), 0,5 г холина bitatrate (Dyets), 1,1 г DL-methione (био-serv, Frenchtown, NJ), 57.5 г lactalbulmine гидролизат (био-serv), 117.5 г декстроза (Dyets), 36.6 мл рыбьего жира (Sigma)и 4,5 г суспендирующий агент K (био-serv) в расчете на 1000 мл объем. Регулярные чау для крысы (PicoLab® грызунов диета 20) был приобретен у LabDiet (LabDiet, Брентвуд, MO). Калории регулярно чау были предоставлены на 25% из белка, 13% из жиров, и 62% из углеводов, а калорий, высокое содержание жира в диете были представлены на 35% из белка, 30% жира и 35% - из углеводов. Выбор LBP-доза на основе наших предыдущих исследованиях на острые и хронические заболевания печени моделей^14,15. После двенадцати недель, крысы были убиты передозировки наркоза (150 мг/кг pentobarbital, внутрибрюшинное введение) согласно протоколам, утвержденным комитетом использования животных для научных исследований и преподавания в университете Гонконга после 12 ч голодания. Крови и печени были взяты образцы для дальнейшего анализа.

Переработка донорской крови и образцов тканей

Сыворотки собирали путем центрифугирования из образца цельной крови на 1000 × g в течение 10 мин при 4°C и хранят при -80°C. образцы ткани печени фиксировали в 10% - фосфат-забуференном растворе формалина, обработанные для гистологии и внедренные в парафиновые блоки. Пять-микрометр ткани, срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), Sirius red и synaptophysin (DAKO, Дания) для гистологического анализа с использованием LEICA Qwin Image Analyser (Leica Microsystems Ltd., Милтон Кейнс, Великобритания). В НАЖБП балл активности (NAS) каждой группы был рассчитан, как описано ранее¹⁷.

Сыворотке крови АЛТ и АСТ анализа

Для оценки поражения печени при ферментативной уровень в сыворотке, АЛТ и АСТ уровни были измерены с помощью ALT (SGPT) и АСТ (SGOT) и реагентов (наборов) (Teco diagnostics, Anaheim, CA) в соответствии с инструкциями производителя.

Свободные жирные кислоты (FFA) анализа

Для изучения влияния LBP на метаболизм липидов в сыворотке FFA на каждом уровне крыс измеряли с помощью Cayman свободных жирных кислот assay kit (Cayman chemical, Ann Arbor, MI), а окончательные результаты были выражены в виде мкм в сыворотке крови.

Измерение мда уровне

Уровень конечного продукта перекисного окисления липидов (малонового диальдегида, мда) в ткани печени образцов были определены с помощью Bioxytech пол-586™ kit (Oxis исследования, Portland, or). Продукт реакции регистрировали спектрофотометрически при 586 нм. Стандартные кривые были построены с помощью 1,1,3,3-tetraethoxypropane в качестве стандарта. Мда уровни были нормализованы с соответствующего белка суммы определяется Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) и выражали в процентах от контроля уровня.

Инсулин-толерантный тест (ИТТ) и глюкозо-толерантный тест (ГТТ)

Измерения ITT и ГТТ проводили, как описано ранее¹⁸ с изменениями в соответствии с Вандербильта рекомендации по оценке гомеостаза глюкозы¹⁹. Кратко, после 12-недельного НАЖБП индукции, крысы были помещены в чистые клетки при голодании государства, но с подачей воды в течение 6 часов. Затем у крыс, подвергнутых ITT или ГТТ анализы были внутрибрюшинно (В / Б.) инъекции рекомбинантного инсулина (фиксированная болюс 0,17 ме, R&D systems, Minneapolis, MN) или D-глюкозы (фиксированная болюс 350 мг, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), соответственно. Мы используем фиксированный болюсного инсулина или глюкозы, потому что мышечной массы тела (например. мышцы, печень, мозг) был основной сайт утилизацию глюкозы, даже если ожирение вызвано в основном за счет увеличения жировой массы. Администрирование глюкозы на единицу веса тела основе будет повышение глюкозы в дозе непропорционально в отношении основных глюкоз-использовать ткани¹⁹. 0, 20, 40, 60, 80 и 100 мин после инсулина/глюкозы для инъекций, хвост забор крови из вены каждой крысы были протестированы на уровень глюкозы непосредственно с помощью ACCU-CHEK blood glucose monitoring system (Roche Diagnostic, Базель, Швейцария). Уровни инсулина в сыворотке крови уровней были количественно с использованием коммерческих ИФА-наборы от антител и Иммуноферментный служб университета Гонконга (Гонконг, Китай). Базальных концентраций глюкозы в плазме крови наблюдались также для нормализации результатов ГТТ¹⁹.

ИФА

ELISA измерений TNF-α, IL-1β, и MCP1 были выполнены с помощью соответствующих ELISA development kits от PeproTech (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) в соответствии с инструкциями по эксплуатации. ЦОГ-2 ИФА было проведено с комплекта от EIAab (Wuhan EIAab науки, Ухань, Китай). TGF-β1 и α-SMA ИФА-наборы были от eBioscience (San Diego, CA) и MyBioSource (San Diego, CA), соответственно.

Вестерн-блот анализ ткани печени экстрактов проводили, как описано⁶. Отношение оптической плотности белковых продукта для внутреннего контроля (β-актин), были получены и были выражены в виде коэффициента или в процентах от контрольных значений в цифрах.

NF-κB деятельности

Активность фактора транскрипции NF-κB p65 измеряли с NF-κB/p65 ActivELISA комплект из IMGENEX Corporation (San Diego, CA) согласно инструкции пользователя.

Культура клеток и процедуры

Крыса гепатоцитов BRL-3A клеточной линии был поставлен банка клеток типа культуры коллекцией китайской Академии наук в Шанхае (КНР) и культивировали в RPMI-1640 с 10% (v/v) FBS при 37°C и 5% CO₂ с помощью мобильного инкубатор. Когда клетки достигли слияния 60-70%, они были разделены на 8 групп (n = 5), в том числе: (1) контрольная группа (с PBS, который был растворитель для LBP); (2) жировой гепатоз группы [получавших пальмитат кислоты (PA)]; (3) транспортного средства-LBP группы (получавших LBP); (4) жировой гепатоз + LBP группы (получавших па и LBP); (5) транспортного средства-арабинозы группы (получавших 3 мм l-арабинозы); (6) стеатоз + арабинозы группы (получавших па и 3 мм l-арабинозы); (7) транспортного средства-каротин группы (получавших 2 мкм β-каротина); и (8) стеатоз + каротин группы (получавших па и 2 мкм β-каротин). Продолжительность лечения составила 24 часов. Липидные накопления в каждой группе было обнаружено, что масло красного O окрашивание. От подбора дозы l-арабинозы²⁰ и β-каротин²¹ была основана на предыдущих in vitro отчеты.

МТТ-теста

Жизнеспособность клеток оценивали по конверсии 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромида (МТТ, Sigma-Aldrich) в фиолетовый цвет продукта с помощью клеточных митохондрий. После медикаментозного лечения, клетки из каждой группы были промыты стерильным PBS 3 раза, а затем инкубировали с 5 мг/мл МТТ в течение 3 часов, и впоследствии, растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО). Абсорбция МТТ измеряли при 570 нм.

Производство глюкозы анализа

После обработки клетки промывали стерильным PBS 3 раза, чтобы удалить глюкозы, а затем инкубируют в течение 16 часов в производство глюкозы среднего (глюкоза и феноловый красный-бесплатный DMEM, содержащей gluconeogenic субстратов, 20 мм лактата натрия, 2 мм пирувата натрия) в присутствии 1 нм инсулина (R&D systems) в течение последних 4 часов. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью коммерческого набора от Sigma. Концентрация глюкозы нормализовался с соответствующими клеточными концентрации белка.

Количественное определение апоптотических клеток

После медикаментозного лечения, Hoechst 33342 (5 мкг/мл) и йодистый пропидий (5 мкг/мл) добавляли в каждую лунку, чтобы не испачкать живых клеток. Результаты были выражены как процент апоптоза (па): па = апоптотических клеток число/общее число ячейки × 100%²².

Деятельность каспазы - 3/7

Деятельность каспаз-3 и -7 от печени лизаты тканей и клеточные лизаты были измерены с использованием Каспазы-Glo 3/7 Assay систем (Promega, Madison, WI) в соответствии с руководством пользователя. Свечение было прочитать в люминометр Glomax (Promega) и выражены как стадо изменения в каспазы 3/7 деятельности от контроля.

Выделения РНК и количественной ПЦР

Общей РНК из каждой крысы выделяли из печени образца или клеточных лизатов с помощью illustra™ RNAspin mini kit (GE healthcare, Великобритания). Подготовка first-strand cDNA было проведено в соответствии с поручением SuperScript™ First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Calsbad, CA). Уровни экспрессии мРНК генов-мишеней, измеряемой Takara SYBR премикс Taq количественный ПЦР-тест системы (Takara Bio Inc, Shiga, Япония) с использованием MyiQ2 ПЦР в реальном времени машина (Bio-Rad). Праймер последовательности и температур отжига, используемые в этих real-time PCR реакции перечислены в Suppl. Таблица S1. Параллельное усиление глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) был использован в качестве внутреннего контроля. Относительной квантификации было сделано с помощью 2^-ΔΔCt метод. Относительная экспрессия определенного Гена внутреннего контроля, были получены и тогда, выраженная как процент от контрольных значений в цифрах. Все ПЦР в режиме реального времени процедур, в том числе дизайн праймеров, проверка ПЦР среды и методы количественной оценки проводились по MIQE руководящего²³.

Статистический анализ

Данные из каждой группы были выражены, а значит, ± SEMs. Трапециевидное правило, использовалась для определения площади под Кривой (AUC). Статистические сравнения между группами проводились с использованием тест Крускала-Уоллиса, с последующим Dunn's post hoc тест для выявления различий во всех группах. В p < 0,05 считалось статистически значимым (Prism 5.0, Graphpad software, Inc., Сан-Диего, CA, США).