Lycium barbarum увеличивает калорийность расходы и уменьшает окружность талии у здоровых полных мужчин и женщин: пилотное исследование

1. Введение

Апоптоз или запрограммированная гибель клеток может быть вызвана различными сигналами, и характеризуется четко определенными морфологическими изменениями, в том числе конденсации хроматина и фрагментация, и формирование апоптотических тел [4]. Сетчатки микрососудистой клетки потеряны выборочно через апоптоз перед другими гистопатология обнаруживаемая при диабете [5]. Более того, недавние исследования показали, что апоптоз, эпизоды клеток сетчатки при начальной стадии диабета играют важную роль в ранней стадии потери зрения [6]. Таким образом, апоптоз является важным в развитии и патогенезе DR [7].

Ретинального пигментного эпителия (РПЭ) клетки образуют монослой между neuroretina и choriocapillaris, которые являются непременным составляющим внешнего крови ретинального барьера (BRB), которая поддерживает физиологический и структурный баланс в сетчатке глаза [8]. ООО НПП клетки особенно чувствительны к окислительному стрессу из-за высокого потребления кислорода фоторецепторов [9]. Более того, недавние исследования показали, что клетки РПЭ пройти окислительного стресса и УФ-индуцированного апоптоза [10, 11]. Хотя несколько исследований показали, что РПЭ вырождается в ранней стадии сахарного диабета [12, 13], механизмы высокого глюкозы-индуцированный апоптоз клеток РПЭ моделей DR, полностью не поняты.

Высокая глюкоза вызывает активацию ряда белков, участвующих в апоптотической гибели клеток, в том числе членов каспазы семьи [14]. Хорошо известно, что каспаз вовлечены в инициацию и выполнение апоптоза [15]. Кроме того, широко изученный каспазы-3 играет важную роль в диабете [16].

Недавние исследования показали, что лиганд-активировать PPAR-γ контроль апоптоза, способствуя защиты тканей [17]. Действительно, было показано, что PPAR-γ агонист росиглитазон защищает от окислительного стресса-индуцированного апоптоза через регуляция антиапоптотических Bcl-2 семейство белков [18]. Troglitazone показал цитопротекторную активность от окислительный стресс-индуцированного апоптоза в ARPE-19 клеток [19]. Кроме того, исследование показало, что природный лиганд, 15-дезокси-Дельта-12,14-простагландин J₂ (15d-PGJ₂), помогает клеток РПЭ для поддержания целостности митохондриальной по профилактике цитохрома с (cyt c) высвобождение из митохондрий и активацию апоптоза пути [20].

Из фруктов Lycium barbarum L. (LB) в семейства Пасленовых являются хорошо известной традиционной китайской медицины, которая имеет сахароснижающей активности и антиапоптозной активностью [21]. Растет объем фактических данных о том, что LB доза повышает в плазме натощак зеаксантин уровнях, полезно для поддержания плотность пигмента в макуле при возрастной макулярной дегенерации [22]. Кроме того, полисахариды фунт (LBP) увеличение антиапоптотических белков Bcl-2 уровня в объектив эпителиальных клеток [23]. LB содержит 18 видов аминокислот, в том числе таурин, ненужные свободных аминокислот, которая является одним из химических компонентов, наиболее распространенных в LB [24, 25]. Таурин был рекомендован в качестве дополнительного терапевтического агента для профилактики диабетических осложнений при сахарном диабете II типа [26]. Кроме того, было показано, что таурин ингибирует активацию каспазы-3 в ишемизированных кардиомиоцитов [27]. Таурин также было установлено, чтобы предотвратить высокое-глюкоза-опосредованный апоптоз эндотелиальных клеток через его антиоксидантные свойства [28]. Недавно мы показали, что LB экстракт и чистый таурин, важный компонент в LB, экстракт активации PPAR-γ по люциферазный репортерный ген анализ и мРНК и вестерн-блоттинга измерения в пигментного эпителия сетчатки клетки. В то же время, как фунт экстракт и чистый таурин ингибирует различные PPAR-γзависимые от нижестоящих эффекторов в клетки сетчатки [29]. Однако, эти пути, благотворно отразится LB и его активный компонент таурин на DR путем модуляции высокого глюкозы-индуцированного апоптоза через PPAR-γ-опосредованных каспазой-3 путь не исследованы. Таким образом, целью данного исследования является изучение цитопротекторный эффект чистого таурин и экстракт LB богаты таурином против воздействия глюкозы в человеческом отслоение эпителиальных клеток линии как модель д-р

2.1. Подготовка LB экстракт

Сушеные фунт был куплен в сыром виде порошка (batch no. 53101: DeDu Holdings, Уэст-Райд, Австралия). Приготовление экстракта LB проводили, как описано ранее [29, 30] с модификациями. Кратко, 250 мг изобразительных LB порошок экстрагировали 2.5 мл метанола путем разрушения ультразвуком при комнатной температуре в течение 15 мин с последующим центрифугированием в течение 5 мин. Этот шаг был повторен четыре раза. Растворитель затем выпаривают при пониженном давлении ниже 50°C, а оставшиеся твердые были собраны. Идентификация и количественное определение таурина в LB экстракт проводились методом тонкослойной хроматографии (ТСХ-анализ), как описано ранее [29].

2. 
   Культура тканей и лечение
   

Человеческой сетчатки эпителиальной клеточной линии, ARPE-19, был предоставлен д-ром Weiyong Shen (сохранить зрение институт, Сидней, Австралия). Клетки культивировали, как описано ранее [31]. Кратко, клетки культивировали в увлажненный инкубатор при 37°C в 5% CO₂ в 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота-определяется минимально необходимых среднего (FBS-DMEM)-F12 medium), содержащую 5,5 мм D-глюкозы, дополненной 100 U/мл пенициллина G и 100 μг/мл стрептомицина. Культуральная среда заменялась свежей среды каждый второй день. После слияния культур были passaged путем диссоциации 0,05% (w/v), трипсина (Gibco-Life Technologies, Roseville, штат Мэриленд, США) в фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), рН 7,4. Для высокого глюкозы-индуцированных функциональных исследований, клетки культивировали в свежей среде, содержащей 1% FBS, 2 ч до использования в экспериментах. Клетки были затем предварительно обработанные образцы, росиглитазон (RG), 15-дезокси-Дельта (12, 14)-простагландин J₂ (PG), или автомобиль (на 0,5% ДМСО) в течение 6 ч с последующим выдержкой в нормальных (5.5 мм) или высокой (33.3 мм) D-глюкозы в течение 48 ч. Клетки инкубировали в 27.5 мм маннита (м) служил в качестве осмотического контроля [32].

2.3. Жизнеспособность клеток MTS Assay

Пролиферацию клеток оценивали по 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ил)-5-(3-carboxymethoxy фенил)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (МТС) анализа с использованием клеток титр 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA), как описано ранее, с некоторыми модификациями [33]. Кратко, ARPE-19 клеток культивировали в 96-луночных планшетов (3 × 10⁴/мл). После слияния клетки были обработаны автомобиля (0.05% ДМСО), RG, колхицина (Colch), или образцы для 24 ч, 48 ч и 72 ч. Для высокого глюкозы цитотоксичность экспериментов, в среду заменяют свежей средой, содержащей 1% FBS, 2 ч до использования в экспериментах. Клетки были затем preincubated с лечением образцы, RG, PG, или транспортного средства (на 0,5% ДМСО) в течение 6 ч с последующей выдержкой в нормальных (5.5 мм) или высокой (33.3 мм) D-глюкозы еще на 48 ч. На день proliferation assay, 20 μL МТС добавляли раствор каждой из 96 лунок, и инкубировали при 37°C в течение 1 ч в увлажненных (5% CO₂) среды. Поглощение при 490 нм было прочитать в микропланшетный ридер (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA). Процент пролиферации клеток рассчитывали как (OD обработанных проб/OD неочищенных контроля) × 100.

2.4. Выявление Апоптотических клеток

Клетки происходит апоптоз определяли с помощью Hoechst 33342 окрашивание и Аннексина V проточной цитометрии анализа, как описано ранее, с модификациями [4]. Кратко, клетки фиксировали в 4% формальдегиде в течение 10 мин и окрашивали красителем Hoechst 10 мин. Клетки были визуализированы под инвертированный люминесцентный микроскоп (возбуждения при 365 нм и эмиссии на 480 нм, используя УФ-фильтра). Не менее 300 клеток в каждой покровным стеклом, из шести случайно выбранных полей, были подсчитаны, и апоптотических клеток были выражены в процентах от общего объема клеток графов.

2.5. Количественное определение Апоптотических клеток

Апоптотические клетки были количественно методом проточной цитометрии с использованием FITC Аннексин V apoptosis detection kit (BD Biosciences, San Jose, USA), как описано ранее [34]. Кратко, после соответствующего лечения, 1 × 10⁵ клеток/100 μL были собраны, и 5 μЛ FITC Аннексина V и 5 μЛ пропидия (PI) были добавлены. Клетки инкубировали в темноте при 25°C. после 15 мин, 400 μЛ 1x привязки буфер был добавлен к клеткам. На Аннексин V-положительный (+)/PI-отрицательный (-) клеток, указывая на ранних апоптотических клеток, и Аннексин V-положительный (+)/PI-положительный (+), указывая на поздних апоптотических клеток, были обнаружены FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, USA). Результаты были проанализированы, используя WINDI 2.5 программное обеспечение. Аннексин V-FITC конъюгатов были обнаружены в канале FL1, и PI был прочитан FL3 канала.

2.6. Каспазы-3 Анализа Деятельности

Каспазы-3 активность измерялась с помощью каспазы-3 флюориметрического анализа системы (BD Biosciences, San Jose, USA), как описано ранее [35] с модификациями. Ненадолго, всего от 1 × 10⁶ клетки собирали и ресуспендировали в холодном помещении лизис-буфера (10 мм Трис-HCL, 10 мм NaH₂PO₄/NaHPO₄ (pH7.5), 130 мм NaCl, 1% Triton-X-100 и 10 мм пирофосфат натрия (Наппи)) за 30 мин на льду. Лизат клеток концентрации белков определяли по ДСС (bicinchoninic кислоты) анализа (Thermo, США) согласно инструкции производителя. Равные количества белка были добавлены в каждую лунку в 96-луночный планшет, содержащий 200 μЛ HEPES буфер и 5 μL эффективных субстрата, DEVD-AMC (7-амино-4-methylcoumarin), и инкубировали 1 ч при 37°С. расщепление субстрата активной каспазы-3 привело к увеличению флуоресценции (возбуждение = 380 нм и эмиссии = 460 нм), измеренные в 96-луночный планшет флуорометр (FLUOstar OPTIMA), и выражен как единица на миллиграмм белка.

2.7. Извлечения белка и Полуколичественного анализа вестерн-Блоттинга

Immunoblots были проведены, как описано ранее [36]. Белки из клеток были подготовлены с использованием рипа лизис буфера (25 мм Трис-буфера (pH 7,6), 150 мм NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолатом натрия и 0,1% SDS). В лизированных клеток центрифугировали со скоростью 12000 об / мин (Micromax РФ центрифуга Thermo IEC, MA, USA) в течение 10 мин и supernatants решены с помощью SDS-PAGE, 4-12% (Invitrogen, Австралия). Белка была передана целлюлозы мембраны в передаче буфера (Tris base 25 мм, глицин 192 мм, рН 8,3) и блокировали в 5% обезжиренного сухого молока (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) на ночь. Первичные антитела (Santa Cruz Biotechnology, США) были anticaspase-3 кролик поликлональных первичных антител (1 : 500 разбавления). После инкубации с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, мембрану промывают и далее инкубировали с пероксидазой хрена-конъюгированных анти-мышь вторичных антител (1 : 6000 разбавления; Santa Cruz Biotechnology, США). Связанные антитела были обнаружены с помощью усиленной хемилюминесценции с Lumi-свет вестерн-Блоттинга субстрата (Roche). Мембраны подвергались рентгеновская пленка (Kodak, США) и разработана с помощью SRX-101A X-ray developer (Konica, Тайвань). Результирующая фильмы были количественно определены методом сканирующей денситометрии с помощью ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Экспрессия белков была определена количественно с помощью нормализации, чтобы α-тубулина. Мембраны были reprobed с Анти-α-тубулина первичных антител (1 : 10,000 разбавления; Santa Cruz Biotechnology, США) после зачистки и ночь блоттинга с 5% обезжиренным молоком. Мембраны были reincubated пероксидазой хрена)-конъюгированных анти-мышь вторичного антитела и выявляют с помощью той же процедуры, как описано выше. Лизат клеток концентрации белков определяли по ДСС (bicinchoninic кислоты) анализа (Thermo, США) согласно инструкции производителя.