Treści programowe dla kierunku studiów: biotechnologia Studia pierwszego stopnia – studia licencjackie Rok akademicki 2012/2013

2. 
   Kształcenie w zakresie biologicznych aspektów biotechnologii
   

Transkrypcja genów prokariotycznych. Elementy typowego promotora. Budowa pol RNA. Rola podjednostki sigma w inicjacji transkrypcji. Represory bakteryjne i fagowe. Terminacja rho-zależna i rho-niezależna.

Transkrypcja genów eukariotycznych. Remodelowanie chromatyny. Eukariotyczne pol RNA i ich specyficzne promotory. Ogólne czynniki transkrypcyjne, białko TBP. Sekwencje wzmacniające i wyciszające, czynniki transkrypcyjne, typy białek wiążących DNA. Rola czynników transkrypcyjnych w rozwoju na przykładzie Drosophila.

Integracja transkrypcji przez pol II RNA i procesów dojrzewania - rola domeny CTD. Czapeczkowanie. Mechanizm wycinania intronów, rola snRNA U i białek splicingowych. Typy intronów. Alternatywny splicing, transsplicing. Terminacja transkrypcji i poliadenylacja.

Dojrzewanie transkryptów tRNA – dojrzewanie na końcach 5’ i 3’, usuwanie intronów, modyfikacje zasad.

Dojrzewanie transkryptów pol I RNA – rola RNaz i snoRNA z motywami C/D oraz H/ACA.

Edytowanie RNA.

Rybozymy.

Stabilność RNA. Mechanizmy degradacji RNA.

Translacja – rola białek G. Mechanizm inicjacji translacji. Kontrola inicjacji translacji przez inhibicję zwrotną, inhibitorową fosforylację eIF-2α, stymulującą fosforylację PHAS-1, struktury szpilek do włosów, białka wiążące elementy IRE. Elongacja translacji-udział EF-Tu i EF-G oraz transferazy peptydylowej. Czynniki RF i RRF terminujące translację.

Rekombinacja homologiczna. Modele Hollidaya, Meselsona-Raddinga i Szostaka. Białka E. coli biorące udział w rekombinacji. Eukariotyczne homologi białka recA. Rola białek RuvA i B w tworzeniu struktury Hollidaya i migracji rozgałęzienia. Białka RecBCD inicjują rekombinację w miejscach chi.

Rekombinacja zlokalizowana na przykładzie integracji faga λ, zmiany typu koniugacyjnego drożdży, zmiany antygenu wici u Salmonella.

Transpozycja, rola sekwencji powtórzonych. IS i Tn u bakterii. Eukariotyczne transpozony i retrotranspozony.

Rekombinacja VDJ w tworzeniu przeciwciał.

HIV i AIDS.

Niekodujące RNA. Rola mi/siRNA w TGS i PTGS.

Lewin B., Genes V-VII.

Turner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H., Biologia molekularna. Krótkie wykłady. PWN, Warszawa 2004.

Węgleński P. (red), Genetyka molekularna. PWN, Warszawa 1998.

Liczba punktów ECTS: 3,5

Nabycie umiejętności: pracy w warunkach aseptycznych, przygotowania podłoży do hodowli roślin in vitro, wyprowadzenie sterylnych linii komórkowych i tkankowyvh, zapoznanie się z prowadzeniem różnych typów hodowli tkankowych, regeneracji rośliny z różnego typu materiału donorowego, technikami klonowania roślin, oceny zmienności somaklonalnej na poziomie morfologicznym i aklimatyzacji regenerantów.

Przygotowanie podłoża do hodowli kultur in vitro. Sterylizacja materiału roślinnego różnego typu. Zakładanie kultury siewek, wierzchołków wzrostu, kalusowej. Organogeneza pędów i korzeni oraz somatyczna embriogeneza u tytoniu. Techniki klonowania i mikropropagacji roślin. Kultury korzeniowe. Zawiesina komórkowa. Zmienność somaklonalna. Aklimatyzacja regenerantów do warunków kultury ex vitro.

Fizjologia roślin pod redakcją Jana Kopcewicza i Stanisława Lewaka PWN (Rozdział 7 i 10)

Biotechnologia roślin pod redakcją Stefana Malepszego PWN

Hodowla komórek i tkanek roślinnych pod redakcją Macieja Zenktelera PWN

Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin pod redakcją Barbary Michalik
KULTURY TKANOWE ZWIERZĄT
Typ przedmiotu: obligatoryjny

Poziom przedmiotu: 15 godzin wykładu, 30 godzin ćwiczeń

Rok studiów, semestr: II, semestr III

Liczba punktów ECTS: 3,5

Metody nauczania: wykład z prezentacją multimedialną oraz zajęcia laboratoryjne

Wykładowca: dr Katarzyna Roszek

Prowadzący zajęcia laboratoryjne: dr Katarzyna Roszek, dr Joanna Czarnecka

Wymagania wstępne: podstawowe wiadomości z zakresu biochemii biologii komórki

Cele przedmiotu: Zapoznanie się z metodyką pracy z hodowlami tkankowymi i komórkowymi, sposobami izolowania komórek do hodowli, sposobami prowadzenia hodowli komórek embrionalnych i dojrzałych. Poznanie źródeł pozyskiwania, sposobow hodowli, kierunków i kontroli różnicowania in vivo oraz in vitro komórek macierzystych. Studenci poznają sposoby wykorzystania hodowli komórek in vitro do produkcji białek rekombinowanych, jako modelu w badaniach cytotoksyczności oraz w regeneracji tkanek i narządów.

Nabycie umiejętności: pracy w warunkach aseptycznych, przygotowania podłoży do hodowli in vitro, zakładania hodowli komórek z tkanek embrionalnych i zróżnicowanych. Studenci nabędą umiejętności utrzymania komórek zwierzęcych w hodowli in vitro, pasażowania i zamrażania komórek, oceny przeżywalności i metabolizmu komórek w hodowli, oceny wpływu substancji toksycznych oraz oznaczania markerów starzenia się komórek

Treści merytoryczne przedmiotu: Studenci poznają zagadnienia dotyczące:

Organizowania i wyposażenia pracowni hodowli komórek zwierzęcych

Warunków środowiska hodowlanego

Biologii komórek hodowanych in vitro

Pozyskiwania komórek do hodowli in vitro i uzyskiwania linii komórkowej

Modele in vitro i ich zastosowanie we współczesnej biologii, biotechnologii i medycynie

Produkcja białek rekombinowanych w komórkach hodowanych in vitro. Przeciwciała monoklonalne

Komórki macierzyste – źródła, potencjał i kontrola różnicowania komórek macierzystych, aplikacje kliniczne oraz perspektywy zastosowania komórek macierzystych

Komórki macierzyste nowotworów

Zajęcia laboratoryjne umożliwią poznanie i praktyczne wykorzystanie wiedzy dotyczącej pracy w warunkach aseptycznych oraz zakładania i utrzymania komórek zwierzęcych w hodowli in vitro. Poruszane zagadnienia dotyczą:

Zasady prowadzenia hodowli komórek i tkanek zwierzęcych. Przygotowanie odczynników i pożywek do hodowli komórek zwierzęcych

Zakładanie hodowli pierwotnych komórek prawidłowych z tkanek dorosłych zwierząt (metoda eksplantów)

Zakładanie hodowli pierwotnych komórek prawidłowych z tkanek embrionalnych z zastosowaniem enzymów proteolitycznych

Hodowla komórek linii ustalonej CHO – rozmrażanie komórek i zakładanie hodowli. Sposoby liczenia komórek.

Hodowla komórek linii ustalonej CHO – pasażowanie i zamrażanie komórek

Praktyczne wykorzystanie hodowli in vitro (ocena wpływu substancji toksycznych na żywotność komórek w hodowlach)

Oznaczanie kwaśnej ß-galaktozydazy jako markera starzenia się komórek

Metody oceny/ sposób zaliczenia: obecność na zajęciach laboratoryjnych, pozytywna ocena z kolokwium zaliczeniowego, pozytywna ocena z egzaminu pisemnego

Spis zalecanych lektur:

Kłyszejko – Stefanowicz L. „Cytobiochemia (Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002)

Kilarski W. Strukturalne podstawy biologii komórki (Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003)

Kawiak J., Seminaria z cytofizjologii dla studentów medycyny, weterynarii i biologii (Elsevier Urban &Partner, Wrocław 2002)

Stukłosowa S., Hodowla komórek i tkanek (PWN, Warszawa 2006)

Freshney R. I., Culture fo Animal Cells: A manual of Basic Technique (Wiley, Nowy York 2005)

Na wykładach studenci zostaną zapoznani z laserową mikrodyssekcją, jako nową techniką użyteczną w diagnostyce medycznej. Przedstawiony zostanie problem konwolucji i dekonwolucji obrazów (redukcji błędów odwzorowania obrazu preparatu) oraz wybrane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej. Zostaną omówione wybrane molekuły wykrywane w preparatach histopatologicznych, jako markery nowotworów człowieka.

Na ćwiczeniach studenci zapoznają się z metodami rekonstrukcji całego preparatu na jednym obrazie mikroskopowym i możliwościami automatycznego wykrywania, analizy i pomiaru obiektów w preparatach mikroskopowych. Ponadto zaprezentowane będą możliwości tworzenia trójwymiarowych obrazów komórek oraz dekonwolucja obrazów mikroskopowych, a także obrazowanie o pogłębionej ostrości. Analizowane będą wyniki reakcji immunohistochemicznych i hybrydyzacji in situ wykrywania określonych molekuł. Studenci zapoznają się z możliwościami, jakie daje wykonywanie obrazów w różnych pasmach wzbudzenia i emisji fluorescencji oraz określaniem stopnia kolokalizacji wykrywanych molekuł. Zaprezentowane zostaną także metody akwizycji pełnej dokumentacji fotograficznej preparatów we fluorescencji i w świetle białym przy maksymalnym ograniczeniu zjawiska fotowybielania fluorochromów.

Metody oceny / sposób zaliczenia: obecność na zajęciach laboratoryjnych i zaliczenie kolokwium

Spis zalecanych lektur:

Wegerhoff R., Weidlich O., Kässens M. – “Basics of Light Microscopy Imaging“, Git Verlag A Wiley Company, Darmstadt, Olympus, Hamburg, 2007;

“Fluorescence imaging collection”, Nature Reviews, S3-S41, 2007;

Espina V., Wulfkuhle J.D., Calvert V.S., VanMeter A., Zhou W., Coukos G., Geho D.H., Petricoin E.F., Liotta L.A. – “Laser-capture microdissection”, Nature Protocols, Vol. 1 (586-603) 2006;

Fend F., Raffeld M. – “Laser capture microdissection in pathology”, Journal of Clinical Pathology, Vol. 53 (666-672) 2000;

Allen V.J. – “Protein localization by fluorescence microscopy. A practical approach.”, Oxford University Press, New York, 2000;

Rost F.W.D. – “Fluorescence microscopy”, Cambridge University Press, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, Vol. 1-2, 1992.
BIOTECHNOLOGIA ROŚLIN I ROŚLINY TRANSGENICZNE
Typ przedmiotu: obligatoryjny

Poziom przedmiotu: 30 godzin wykładu, 45 godzin zajęć laboratoryjnych

Rok studiów, semestr: III rok studiów pierwszego stopnia kierunku biotechnologia, semestr letni

Liczba punktów ECTS: 5

Metody nauczania: wykład z prezentacją multimedialną, dyskusja, demonstracja procedur w postaci filmu, zajęcia praktyczne: praca w warunkach aseptycznych, analiza makroskopowa i mikroskopowa regenerantów, praca z kulturami bakteryjnymi, analiza mutantów auksynowych i fotomorfogenetycznych A. thaliana

Wykładowca: prof. dr hab. Andrzej Tretyn

Prowadzący zajęcia laboratoryjne: dr Alina Trejgell, dr Justyna Wiśniewska, mgr Kamila Dunajska-Ordak, mgr Magdalena Sidłowska

Wymagania wstępne: umiejętność obliczeń stężeń roztworów, budowy anatomicznej rośliny (łodyga i korzeń, liść, kwiat), embriogenezy (od zapłodnienia do powstania dojrzałego zarodka rośliny), fizjologii roślin (rodzaje i funkcje naturalnych i syntetycznych auksyn i cytokinin, transport polarny auksyn, fototropizm, geotropizm, powstawanie korzeni bocznych), genetyki (transkrypcja i translacja genu Pro- i Eucaryota, splicing u Eucaryota, obróbka posttranslacyjna genu u Eucaryota)

Cele przedmiotu:

Zapoznanie studentów z etapami tworzenia roślin transgenicznych oraz problemami, które im towarzyszą. Kształtowanie umiejętności: konstruowania transgenu i klonowania do Agrobacterium, zastosowania różnorodnych technik umożliwiających włączenie obcych genów do genomu roślinnego. Manualne opanowanie techniki transformacji roślin z zastosowaniem Agrobacterium tumefaciens. Opanowanie umiejętności: analizy i selekcji regenerantów, transformantów i roślin chimerycznych, określenia lokalizacji ekspresji transgenu za pośrednictwem genów reporterowych - GUS, GFP oraz analizy morfologicznej mutantów A.thaliana. Podsumowaniem zajęć jest przedstawienie przez studentów referatów o zmodyfikowanej genetycznie roślinie, które ma na celu; zapoznanie studentów z najnowszymi osiągnięciami naukowymi, kształtowanie umiejętności analizy publikacji naukowej oraz uporządkowanie zdobytej wiedzy na ćwiczeniach.

Konstruowanie wektorów ułatwiających określenie lokalizacji i poziomu ekspresji wprowadzonych genów do roślin.

Klonowanie transgenu do Agrobacterium.

Pośrednie metody transformacji roślin. Transformacja roślin rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) metodą floral-dip za pomocą Agrobacterium tumefaciens

Selekcja transformantów na pożywkach z różnymi antybiotykami.

Bezpośrednie metody transformacji roślin. Transformacja roślin tytoniu (Nicotiana tabaccum) metodą krążków liściowych za pomocą Agrobacterium tumefaciens.

Analiza wydajności transformacji Arabidopsis thaliana metodą floral-dip za pomocą Agrobacterium tumefaciens oraz przeniesienie transformantów do kultury in vivo.

Geny reporterowe: GUS - jako narzędzia do wizualnej lokalizacji ekspresji wprowadzonych genów. Analiza lokalizacji i poziomu ekspresji genów u wybranych roślin transgenicznych, zawierających gen reporterowy GUS.

Geny reporterowe: GFP, YFP, CFP, RFP, LUC - jako narzędzia do wizualnej lokalizacji ekspresji wprowadzonych genów. Analiza lokalizacji i poziomu ekspresji genów u wybranych roślin transgenicznych, zawierających gen reporterowy GFP.

Mutanty - ich uzyskiwanie oraz znaczenie w badaniach naukowych. Analiza fenotypu wybranych mutantów auksynowych A. thaliana – część I.

Mutanty - ich uzyskiwanie oraz znaczenie w badaniach naukowych. Analiza fenotypu wybranych mutantów fotomorfogenetycznych A. thaliana – część II.

Regeneracja linii stransformowanych roślin tytoniu (Nicotiana tabaccum) metodą krążków liściowych za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Problemy regeneracji roślin. Analiza wydajności transformacji.

Przegląd roślin genetycznie zmodyfikowanych i ich znaczenie gospodarcze.

Przedstawienie referatów przez studentów na temat: ,,Roślina genetycznie zmodyfikowana”.

Przedstawienie referatów przez studentów na temat: ,,Roślina genetycznie zmodyfikowana”.

Metody oceny/ sposób zaliczenia: zaliczenie na ocenę na podstawie kolokwium lub opracowania i przedstawienia prezentacji multimedialnej.

Spis zalecanych lektur:

Malepszy S. Biotechnologia roślin (PWN, Warszawa 2001)

Legocki A. Transformowanie i regeneracja roślin (PAN, 1990)

Kopcewicz J., Legocki St. Fizjologia roślin (PWN, 2002)

Hejnowicz Z. Anatomia i histogeneza roślin naczyniowych - rozdział IV.3, V.1, wydanie nowe 2002

Stryer L. Biochemia (PWN, 1997)

Alberts Biologia komórki

Wiśniewska J., Tyburski J., Tretyn A.: Polarny transport auksyny – przełom w badaniach? Postępy Biologii Komórki, 2004, 31(1), 9-23.

Wykłady: Wektory do klonowania – plazmidy, wektory lambdowe, kosmidy, PACi, BACi, YACi, wektory roślinne. Źródła DNA do klonowania – cDNA, DNA genomowe, DNA namnożone metodą PCR. Metody przygotowania zgodnych końców wektora i DNA do klonowania za pomocą enzymów restrykcyjnych, terminalnej transferazy, doligowania adapterów i ich restrykcji. Ligacja. Zapobieganie samoligacji wektora. Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do komórek gospodarza. Selekcja poszukiwanego klonu – metody hybrydyzacyjne, immunodetekcyjne, funkcjonalne i w oparciu o PCR. Molekularna hybrydyzacja – znaczniki molekularne, metody znakowania kwasów nukleinowych na całej długości, na końcu 5’ lub 3’. Rygorystyczność hybrydyzacji. Hybrydyzacja Southerna. Hybrydyzacje dot/slot blot. ASO - hybrydyzacja allelo specyficznego oligonukleotydu. Hybrydyzacja zoo. RFLP. Hybrydyzacja kolonijna i łysinkowa. In situ hybrydyzacja. Biblioteki cDNA, genów, makro- i mikromacierzowe. Reprezentatywność bibliotek. Biblioteki genów jako wyjścia do tworzenia kontigów – spacerowanie po chromosomach z wykorzystaniem analizy restrykcyjnej, hybrydyzacji Southerna z sondą-sekwencją powtórzoną, PCR na powtarzającym się DNA, PCR specyficznego dla STS. Identyfikacja DNA kodującego – przeszukiwanie poprawnie dobranej biblioteki cDNA, hybrydyzacja zoo, identyfikacja wysp CpG, poszukiwanie eksonów w komórkach COS. PCR – zasada działania, optymalizacja reakcji. Startery zdegenerowane – zastosowanie do klonowania sekwencji homologicznych DOP PCR. Startery zagnieżdżone. Wielokrotny PCR, odwrócony PCR, LP PCR. Zastosowane PCR do badania polimorfizmu i występowania patogennych mutacji – wykrywanie zmutowano badania polimorfizmu i występowania patogennych mutacji - metody ów w komórkch ych sekwencji metodami SSCP, CCM, DGGE, PTT. Badanie pokrewieństwa filogenetycznego – RAPD. Sekwencjonowanie. In vitro mutageneza. Badanie ekspresji genów: porównywanie populacji mRNA z różnych warunków - DD PCR, hybrydyzacja northern i RNA dot-blot, hybrydyzacja in situ, RT PCR w tym ilościowy PCR. Badanie sekwencji regulatorowych genów z użyciem genów reporterowych. Analiza delecyjna. Badanie wiązania białek regulatorowych – test opóźnionej migracji w żelu, analiza śladów z życiem DNazy I, test modyfikacji i zakłócenia modyfikacji, metoda southwestern. Badanie ekspresji i funkcji genu na poziomie białek – western, immunowestern, test prezentacji na fagu. Metody identyfikacji i badania oddziaływań białko-białko: ko-immunoprecypitacja, test prezentacji na fagu, drożdżowy system dwuhybrydowy. GMO. Transgenizacja zwierząt – iniekcja/infekcja obcego DNA do zapłodnionych oocytów, iniekcja genetycznie zmodyfikowanych zarodkowych komórek macierzystych do blastocysty. Mutageneza in vivo – gene targeting, genetyczny nokaut. Technologia antysensowna. Tworzenie GMO roślinnych – z udziałem Agrobacetrium tumefaciens lub metodą strzelby genowej. Terapia genowa. Otrzymywanie i zastosowanie komórek macierzystych.

Ćwiczenia:

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych. Przygotowanie sondy molekularnej - izolacja fragmentów DNA z żelu, znakowanie metodą random priming. Przenoszenie kwasów nukleinowych na nośniki – metoda Southerna, blot kolonijny. Hybrydyzacja, odpłukiwanie niezwiązanej sondy, wizualizacja wyników hybrydyzacji.

Konstruowanie plazmidu kodującego siRNA – izolacja genomowego DNA nicieni, PCR na genomowym DNA, elektroforetyczna analiza produktów PCR, przygotowanie wektora do klonowania produktów PCR, ligacja produktu PCR do wektora, elektroforeza i izolacja z żelu produktu ligacji.

Otrzymywanie szczepu E. coli powodującego RNAi u Caenorhabditis elegant – ukompetentnianie bakterii DH5α, transformacja bakterii produktami ligacji, identyfikacja klonu niosącego produkt ligacji metodą kolonijnego PCR, elektroforeza produktów kolonijnego PCR, izolacja plazmidu niosącego siRNA, ukompetentnianie i transformacja szczepu karmiącego HT115.

Badanie mechanizmu RNAi. Genotypowanie szczepów nicieni metodą PCR. Wyciszanie genu kolagenu C.elegans poprzez RNAi – hodowla nicieni dzikiego typu na szczepie karmiącym E. coli niosącym siRNA, genotypowanie nicieni poddanych RNAi.