Изследване на взаимоотношението растение-патоген при блатното кокиче
|
|  Yüklə 3.57 Mb.
|
3. Взаимодействие между блатно кокиче и бактериални патогени3.1. Сканираща електронна микроскопия (СЕМ)Наблюдавано е, че при култивирането на блатно кокиче in vitro понякога се появявява бактериална зараза без видима причина. Бактериална маса се наблюдава по повърхността на хранителната среда около експлантите и има белезникаво- светло кафяв цвят.Експланти с/без бактериална инфекция са използвани за електроно-микроскопско изследване. При наблюдение със сканиращ електронен микроскоп се вижда, че при заразения експлант бактерията се намира по цялата му повърхност, както и във вътрешността му (фиг. 7). На външен вид бактериите са с дължина около 1 μm, със сферична до яйцевидна форма. Повърхността на незаразения експлант е чиста от бактерия, но във вътрешността му се срещат клетки, в които се забелязват бактериоподобни тела, които се намират както в междуклетъчните пространства, така и във вътрешността на клетките (фиг. 8). Имат подобни на бактериите форма и размери, наблюдавани в заразения експлант.
Фиг. 7 Разпространение на бактерия върху част от заразена “shoot-clumps” култура. а- увеличение х 500; б- снимка при по-голямо увеличение (х 10 000), при което се забелязва формата и големината на бактерията.    
Фиг.8 Бактериална зараза във вътрешността на “чист” експлант (увеличение х 1 000) Влиянието на вътреклетъчните бактерии върху растенията също е различно. Например Herbaspirillum sp. колонизира корени на ориз и участва в азотната фиксация (Ando, 2003). Viano et al. (1991) и Bertea and Camusso (2002) съобщават за ендогенна бактерия в корените на Vetiveria zizanioides (L.). Според Adams et al., 2004 тези бактерии увеличават продукцията на етерично масло от ветиверия. В тъканни култури от декоративни рестения Mycobacterium scrofulaceum се проявява като честа зараза, но появата и в хранителната среда под формата на жълти колонии зависи от някои съставки на средата (Taber et al., 1991). 3.2. Изолиране и идентифициране на бактериални патогени3.2.1. Изолиране на бактериални патогени от луковици на блатно кокичеСимптоми на бактериоза В луковици на блатно кокиче, рекултивирани в района на гр.Тутракан (обл. Силистра) през 2005-2006 г. са наблюдавани два типа симптоми: В една част от луковици кълнът е потъмнял, с намален тургор, изсъхващ. По люспите, основно по връхната им част , се наблюдават сухи, ципести, кафяви петна с ясна граница със здравата тъкан. Сърцевината е тъмнокафява, мека, изсъхваща. Дъното не се различава от това на здравите луковици. Вторият тип симптоми е под форма на меко гниене с тъмнокафяв цвят в сърцевината и видимо здрави кълнове и дъно. От 4 образци на блатно кокиче са получени 10 бактериални изолата, 4 от които предизвикват свръхчувствителна реакция при тютюн (Nicotiana tabacum) на 24 h (Klement et al., 1990). При изкуствено заразяване на люспи от луковици на лук (Allium cepa), изолатите предизвикват меко гниене под форма на оводняване и омекване на тъканите, които придобиват зърнест вид. Цветът на засегнатите части варира от жълто до кафяво в различни нюанси, включително зелено, бежово и червено. С напредване на патологичния процес цветът потъмнява, а тъканите се разпадат при допир. Усеща се средно силна до силна неприятна миризма, с привкус на сварен лук и кисела жилка. Изолатите не проявяват пектолитична активност (фиг. 9).
Фиг. 9. Изкуствено заразени люспи на луковици от лук с бактериални изолати от блатно кокиче. Номерът в долния десен ъгъл на всяка снимка съответства на номера на изолата. 3.2.2. Основни характеристики на бактериалните изолати –В табличен вид са описани основните характеристики на десетте бактериални изолати като: степен на патогенност върху люспи от лук; реакция по Грам; изглед на колониите, отглеждани върху среда КВ; реакция на хиперчувствителност върху тютюневи листа.3.2.3. Симптоми, които предизвикват изолатите при различни гостоприемнициИдентифицираните (6 изолата) и неидентифицирани (4 изолата) от блатно кокиче са патогенни за естествения си гостоприемник и универсалния - лук (Табл. 5). Първите симптоми при всички видове се проявяват на 24 h върху люспи от лале и нарцис и причиняват потъмняване и оводняване на тъканите в мястото на нараняване и около тях. Ясно изразени симптоми по луковиците на гостоприемниците се наблюдават на 5-ти ден:
Табл. 5 Кръг от гостоприемници на изолати от блатно кокиче
* неидентифицирани патогенни изолати 3.2.4. Секвенционен анализСеквенирането позволява идентификация на видово ниво с много голяма точност и в нашите експерименти е приложен за 6 от изолатите. Тези изолати не са описвани до този момент като патогени по блатното кокиче и по други видове от сем. Amaryllidaceae. Te принадлежат към различни семейства бактерии: сем. Xanthomonadaceae - изолат 7, сем. Enterobacteriaceae-изолати 5, 1, 3, 4, и изолат 6 от сем.Bacillаceae.  При амплификация с универсалните праймери F1 и F2, при всички анализирани изолати се наблюдава продукт с очакваната дължина ~1500 бд (Фиг. 10).
.
Установявени са и други два, значително по-слабо амплифицирани продукта при изолати 1, 3 и 4 с приблизителна дължина 550 бд и 750 бд, както и такива с дължина ~300 бд и ~ 600 бд, и ~450 бд (изолат 5) (Фиг. 10). Тези второстепенни продукти не са взети под внимание при обработката на гела, но дават информация за евентуална прилика на изолатите 1, 3 и 4. Резултатите от секвенирането (представени в приложение 6) са обработени с програма BLAST2 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) и дават следните значими съвпадения:
S.plymuthica S. maltophilia и R. aquatilis са почвени микроорганизми, които могат да бъдат патогенни при имунокомпрометирани пациенти (Ramos et al. 1995 Berg et al., 1996 Caroff et al., 1998Berg, 2000 Apistharnthanarak et al., 2003 и др.). Фитопатогенни изолати до момента не са съобщени. Вероятна причина за установяването на S. plymuthica и S. maltophilia в луковици на блатно кокиче са постоянно разширяващите се многобройни ареали на местообитание на фитопатогените по хората и растенията. Изолираните български щамове на S. plymuthica не синтезират червен пигмент – продигиозин (Vivas et al. 2000), върху използваните от нас хранителни среди. Bacillus subtilis е грам - положителна бактерия, която е типичен обитател на почвата. Има данни, че щамове от род Bacillus (както и Pseudomonas, Serratia, Azospirillum) въведени в почвата стимулират растежа на кореновата система и на цялото растение и често подтискат растежа на някои почвени растителни патогени (Kloepper, 1991, Bergstrom and da Luz, 2005). 3.2.5. Анализ на взаимодействието растение –патоген чрез изкуствени заразявания на in vitro луковициАнализирането на това взаимодействие при блатното кокиче е една от основните цели в настоящата дисертация. Поради ограничения природен запас от блатно кокче изкуствените заразявания са извършени върху луковички намножени in vitro. Това дава допълнително предимство, тъй като тези луковички са отглеждани в стерилни условия и така силно се ограничава възможността получените симптоми да се дължат на вторична инфекция. В тази връзка експериментите са проведени при лабораторни условия чрез изкуствено заразяване с 4 бактериални изолата (Изолат 1 - Serratia plymuthica Изолат 3 - Serratia plymuthica, Изолат 5 - Rahnella aquatilis и Изолат 6 - Bacillus subtilis) на луковички получении in vitro и имащи различен произход (Присад, Свиленград, Виница Палаузово, Ямбол, Кочово и Блатец). Приложен е метод за изкуствено заразяване, който е съобразен и адаптиран към целите на нашата работа. Използвани са не отделни люспи, а луковички нарязани надлъжно на половинки за да може да се наблюдава инфекциозността на бактериите върху всяка част от луковиците и всеки момент от инокулирането. Едновременно с това експлантите притежават сравнителна цялост (разполагат с всички части на луковичката (вътрешни, външни люспи, дънце, лист). Контрола: При всички заразявания контролните луковички са накапани с вода и запазват вида си в продължение на целия период на анализ (фиг. 11). При всяко заразяване на всеки in vitro клон кокиче е използвана контрола от същия клон. Поради много сходния външен вид на контролите, тук е показана само тази с произход Виница като пример.
Фиг. 11 Контроли - in vitro луковички с произход Виница. Заразявания с Изолат № 1 - Serratia plymuthicaПри инокулиране с бактериалния изолат №1, засегнатитe тъкани на луковичките имат кремав цвят и водниста консистенция. Те постепенно потъмняват до тъмнокафявo и в последствие изсъхват. Първите симптоми се появяват след 3-тия ден от заразяването и се развиват до 6-тия ден , а след този период не се наблюдава развитие на симптомите в засегнатите части. При изкуствени заразявания с изолат № 1 на in vitro луковички получени от различни находища - Присад, Свиленград 2, Виница, Кочово, Палаузово и Ямбол е проследена реакцията на различните генотипове (фиг. 12). На 9-ия ден от инокулирането на три произхода - Присад, Виница и Кочово се наблюдава потъмнаване на най-вътрешната люспа на луковичките, а при останалите нямаше проява на симптоми.
Фиг. 12 Симптоми при изкуствено заразени луковички с изолат 1 на 9-ти ден след заразяването Заразявания с Изолат № 3 - Serratia plymuthicaПри заразяване с изолат № 3 се наблюдават силно изразени симптоми върху растителните тъкани които се появяват още на втория ден след инокулирането. Първоначално бактерията засяга сърцевината на луковичката и постепенно инфекцията засяга периферните люспи и до 9-тия ден всички ескпланти загиват. Цветът на засегнатите тъкани е тъмно-сивкав, те са воднисти и до края не засъхват. Излъчват силна, неприятна миризма. Според секвенционния анализ изолат № 1 и изолат № 3 са от един и същ вид (Serratia plymutica), но се характеризират с различна вирулентност и степен на нападение върху гостоприемника. При заразяване с изолат № 3 се наблюдават различия в симптоматологията при различните генотипове. Най-слаба е реакцията на луковички от Виница и Палаузово (фиг.15 и 16) при които тъканите изглеждат белезникави и сухи, а най-силна при генотипове от Присад (100%) (фиг.13), Свиленград 2, Кочово и Ямбол (50%) (фиг. 14). 
3-ти ден 6-ти ден 9-ти ден  
Фиг.13 Симптоми на експланти с произход Присад инокулирани с изолат 3 проследени на 3, 6 и 9 ден. 
3-ти ден 
6-ти ден 9-ти ден  
Фиг.14. Симптоми на експланти с произход Свиленград 2, инокулирани с изолат 3 проследени на 3, 6 и 9 ден. 
6-ти ден 9-ти ден 3-ти ден  
Фиг.15 Симптоми на експланти с произход Виница, инокулирани с изолат 3 проследени на 3, 6 и 9 ден. 
3-ти ден
9-ти ден
6-ти ден
 
Фиг.16 Симптоми на експланти с произход Палаузово, инокулирани с изолат 3 проследени на 3, 6 и 9 ден. Заразяване с Изолат №5- Rahnella aquatilisПри заразяване с изолат№ 5 симптоми се появат на 5-6-ти ден след инокулирането. Засягат се главно вътрешните и някои периферни люспи, а петната са тъмни и засъхващи (фиг.40). Изолат № 5 първоначално засяга най-вътрешната люспа, където е заложено бъдещото цветно стъбло. Тази тъкан потъмнява и загнива, без да се засягат останалите люспи. Такава реакция се наблюдава в луковички от Присад, Свиленград, Виница и Кочово, а при тези от Палаузово и Ямбол не се наблюдават симптоми (фиг. 17). 
палаузово виница Свиленград 2      
Фиг. 17 Симптоми при изкуствено заразени луковички с изолат 5 на 9-ти ден след заразяването Заразяване с Изолат № 6 - Bacillus subtilisИзолат № 6 също засяга частично инфектираните с него луковички. Много експланти остават незасегнати, а при останалите повредите са главно периферни и много тъмни на цвят, което напомня реакция на свръхчувствителност. Както и в останалите случаи, симптомите, които се наблюдават върху експлантите, отглеждани на хранителна среда, са по-слаби. Развитието в среда на бактерията е умерено и започва от 6-тия ден. Изолат № 6 е един от най-слабо патогенните изолати включени в нашето изследване. При генотипове от Присад, Палаузово и Ямбол не са наблюдавани симптоми след изкуственото заразяване. Много слаба реакция проявяваща се на 9-ия ден от инокулирането (потъмняване вътрешната част на луковичките) е отчетена при произходите Виница, Кочово и Свиленград (фиг. 18).
Фиг.18 Симптоми при изкуствено заразени луковички с изолат 6 на 9-ти ден след заразяването Проведеното изкуствено заразяване на in vitro луковички с различен произход на блатно кокиче с четири бактериални изолата ни дава основание да твърдим, че проявата на вирулентност на патогена е в зависимост от генотипа на растенията. Инфектираните луковички с произход Присад, Виница и Кочово показват сходна степен на нападение при всички изпитани бактериални изолати като разликата между тях е в типа на нападение (поява на хлороза в сърцевината на луковичките , некроза по външните люспи) и времето на поява на симптоми. Като цяло с най-силна агресивност се откроява изолат № 3 (Serratia plymuthica), а с най-слаба – изолат № 6 (Bacillus subtilis). Изчислен е средният процент заразени луковички с всеки изолат, пресметнат за всички заразявания и за всички заразени клонове. Резултатите са следните: Изолат 1 (Serratia plymutica) заразява около 20 % от инокулираните експланти. Изолат 3 (Serratia plymutica) – над 80%, Изолат 5 (Rahnella aquatilis) – 20%; Изолат 6 (Bacillus subtilis) – под 10% засегнати експланти. Прави впечатление, че при заразяване със същите изолати на отделни луковични люспи повредите са по-големи. Това би могло да се дължи на факта, че когато луковичките са наразани на половинки, бактерията не може да проникне толкова бързо в тъканите в дълбочина и инфекцията се ораничава.
3.2.6 Метаболитен анализИзследван е метаболитния профил на заразени луковички (произход Блатец) с 4 от бактериалните изолати №1-Serratia plymuthica, №3 Serratia plymuthica, №5- Rahnella aquatilis и № 6-Bacillus subtilis, както и този на контролните варианти чрез GC-MS анализ. Същият анализ е направен и на екстракти от лиофилизирана бактериална маса на споменатите изолати. Детектирани са общо 95 вещества, в това число някои амарилисови алкалоиди- галантамин, ликорин, 11-хидроксивитатин. Основните групи вещества са захари (моно-, ди- и тризахариди), аминокиселини, органични киселини, фенолни киселини, мастни киселини, мастни алкохоли, алкалоиди, нуклеинови бази, глицериди, бактериални метаболити и неорганични вещества като фосфорна киселина и пикочна киселина. GC-MS е един от най - използваните подходи за растително метаболитно профилиране. Извършена е идентификация на съединенията по техните мас спектри и индекси на задържане, сравнени с тези, публикувани в достъпните бази. За целите на сравнителното метаболитно профилиране e използвана относителната количествена стойност на метаболитите. Тези стойности са получени чрез нормализиране на интензитета на отделните пикове на база на вътрешните рефернтни съединения, за 50 mg проба. Отделени са по 5 проби (по 1 или 2 половинки в зависимост от теглото) по 50 мг. на случаен принцип. Данните за всяка проба от един вариант са представени поотделно, а не като средно аритметично за варианта. За сравнение на отношенията между отделните варианти суровите данни са обработени по статистически метод, известен като Анализ на главните променливи (РСА). При този метод least -square regression line и от големия набор променливи (метаболити и концентрация) са получени малък брой променливи, според които отделните проби са групирани в пространството без външна намеса. При групирането се отчита максималното вариране на “суровите” данни и проби със сходно вариране или метаболитни профили се обособяват в отделни групи. Резултатите от РСА анализа са показани на фиг. 21 На първата част от фиг. 21 е показано групирането на изследваните проби (score plot) (заразени, незаразени луковици и бактерии), а на втората фигура е варирането на отделните метаболитни групи (loading plot) отговорни за групирането на пробите. Растителните проби (в червено) образуват голяма група, отделна от тази на бактериалните проби (в синьо). Бактералните проби от своя страна са разделени в 2 подгрупи: изолати 1и 6, и 3 и 5. Сравнявайки метаболитните профили на растенията и бактериите се установяват съществени разлики. При бактериалните проби липсват цели групи вещества характерни за растенията като захари, феноли, алкалоиди. Групата от изолати 1 и 6 се характеризира с високи нива на аминокиселини, неидентифицирани бактериални метаболити и фосфорна киселина. Групата от изолати 3 и 5 притежават повече мастни киселини и алкохоли. В бактериите са детектирани специфични неидентифицирани за момента метаболити, които не се срещат нормално в растенията (в контролната група). Следи от тези вещества са отктити в заразени растения, поради което те биха могли да се ползват като маркери за бактериална зараза. Това най-добре се илюстрира от проби 3бк, където е наблюдавано най-силна инвазия и гниене на тъканите. Растенията, заразени с изолат 3 (S.plymutica) се разделят от останалите растителни проби по посока към бактериалните проби, ясно показващо наличие на бактериални метаболити. Проба 3bk7 е извън основните растителени групи и се доближава до бактериалните, но остава отделена и от тях. Вероятно при тази проба инфекциозният процес е бил най- интензивен. В нея се откриват по-високи стойности на следните групи метаболити в сравнение с останалите 3бк проби: фенолни киселини, бази, органични киселини и бактериални метаболити. При РСА анализ само на растителните проби (Фиг. 22) се наблюдава обособяване на по-малки групи. Така например, забелязва се отделяне на пробите на 3 бк и 6 бк от останалите проби. Отново, най-силно се разделят растенията заразени с изолат 3. При заразяване с тази бактерия инфекциозния процес се развива много бързо (още на втория ден след заразяването се наблюдава начало на гниене, а до края на инокулацията луковичките са приблизително 80-100% изгнили) (фиг.19). Вижда се, че в резултат от заразяването въглехидратите силно са намалели, както и алкалоидите, но за сметка на това се е повишило количеството на фенолни вещества и крайни продукти на разраждането като фосфорна киселина, урея и азотни бази. Това може също да бъде обяснено с по-голямата агресивност на изолат 3 и асимилирането на повечето въглехидрати от растението като субстрат за развитие на бактерията.
Фиг. 19. Луковици, използвани за метаболитния анализ - заразени с изолат 3 (ляво) и с изолат 6 (дясно) 
Заразено с изолат5 контрола Заразено с изолат1  
Фиг.20. Луковици, използвани за метаболитния анализ – контролни(ляво), заразени с изолат 1(в средата) и с изолат 5 (дясно)  
 
Фиг. 21 PCA на метаболитните профили на проби от луковици на блатно кокиче (заразени и незаразени) и бактерии. А- score plot; Б - loading plot. Легенда с кодовете на пробите е приложена в т.4.3.3 от „ Материали и методи” . 
Фиг. 22 РСА, показващ разликите в метаболитните профили заразени луковички с четирите бактериални изолата и незаразени луковички (к). А - score plot; Б - loading plot. Легенда с кодовете на пробите е приложена в т. 4.3.3 от „ Материали и методи” При растенията заразени с изолат 6 (B.subtilis) се наблюдава процес на отделяне от основната група на растителни проби. По отношение на наличие на въглехидратите, пробите заразени с изолат 6 са противоположни на тези заразени с изолат 3. Изглежда взаимодействието с изолат 6 принуждава растението да синтезира повече въглехидрати и органични киселини, но не и алкалоиди. Нефотосинтезиращи организми обикновено получават захари, пряко или косвено от фотосинтезиращи организми. Оцеляването на почвените микроорганизми до голяма степен зависи от вида и растежа на околната растителност. Растенията не само доставят органична материя за разграждане, но също така освобождават до 30% от фотосинтезиращи тяхната продукция под формата на ексудати, които привличат и поддържат гъбични и бактериални колонии в почвата (Zhang et al.2008). В нашият експеримент се доказават и двата типа стратегии за доставяне на хранителен субстрат от страна на бактериите. B. subtilis (изолат 6) от една страна, стимулира фотосинтезата на растенията, което е в съответствие с досегашните литературни данни (Paré et al., 2005; Zhang et al.2008). S. plymutica (изолат 3), от друга, явно си набавя хранителните вещества директно, чрез разграждане на тъканите на растението. В достъпната литература до момента няма информация за толкова агресивен щам на този вид бактерия при растенията. Пробите, заразени с изолати 1 (S. plymutica) и 5(R.aquatilis) почти се припокриват, и в голяма степен са подобни на контролата. Това показва, че за времето на експеримента, тези изолати не оказват съществено влияние върху метаболитните профили на заразените растения. На фиг. 20 могат да се видят фенотипните разлики между групите, заразени с изолат 1, изолат 5 и незаразените растения. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
