2. In vitro култивиране на блатно кокиче (L. aestivum L.) 2.1. In vitro размножаване на блатно кокиче
Блатното кокиче е ценен и застрашен от изчезване вид. По тази причина една от задачите, които си поставихме, беше размножаването му чрез прилагане на in vitro технологията и осигуряване на достатъчно растителен материал необходим за бъдещите изследвания.
Развитието на експлантите от луковици започва след края на първата седмица с ветрилообразно разтваряне на люспите. Постепенно меристемата в основата между люспите образува малки бели прорастъци, които в последствие могат да се развият в цели луковички или да образуват “shoot-clumps” тип култура (съвкупност от няколко прорастъка с обща основа). “Shoot-clumps” се образуват при разрастването на частта от дънцето на експланта, като този процес не се свързва с калусогенез и следователно не е предпоставка за генетични изменения.
За въвеждане в култура in vitro е използвана хранителна среда В5II, като развитите експланти са прехвърлени върху средите II и AV, които са на основата на MS (Murashige and Skoog).
Проследявайки поведението на заложените експланти и при други изпитани хранителни среди (с участието на цитокинина TDZ-2 mg/l) се доказва твърдението, че блатното кокиче е доста отзивчиво растение при култивиране в in vitro условия.
Определянето на най-подходящите хранителни среди за развитието на експланти от блатно кокиче при in vitro условия е направено в сравнително проучване на различни варианти на хранителни среди (табл.1).
При изпитването на хранителна среда, свободна от хормони (МВ) се образуват главно луковички, които много лесно се вкореняват. Увеличаването на количеството на захароза до 90 g/l (МВ9) води до значително наедряване на луковиците. Най добрата среда за размножаване и развитие на shoot-clumps е Lp (Pavlov, 2007). Растежът е бърз и се образуват голям брой луковички. На тази среда се наблюдава регенерация и от листа.
Комбинацията на среда Lp с МВ9 позволява много бързо размножаване, нарастване и вкореняване на луковички от блатно кокиче.
Като резултат от приложението на in vitro техниките е разработен ефективен протокол за размножаване на блатно кокиче (фиг. 4).
Фиг. 4 Основни стъпки при in vitro размножаване на блатно кокиче
2.2. Съхранение на in vitro култури при ниски положителни температури.
След едногодишен престой на in vitro култури (луковички и shoot-clumps с произход Вельов вир) от блатно кокиче в хладилник при 4оС, на среда QL0,5BAP** и на тъмно е отчетена 90 % преживяемост. При луковичките се наблюдава етиолиране на листа, което е свързано с липсата на светлина. Пигметнацията се възстановява нормално след поставяне на растенията при обичайните условия във фитостатните помещения. Част от тъканите умират, а при останалите се наблюдава тенденция към развитие на луковички. Получените резултати показват, че е възможно продължително съхранение на блатно кокиче при in vitro условия при ниски положителни температури без да се загуби тяхната жизнеспособност.
2.3. Адаптация на in vitro луковици при оранжерийни условия
Около 1000 бр. регенеранти с добре развита коренова система са адаптирани в почва за последващи изследвания и селекция. Развитието на растенията, зависи от размера на регенериралите луковички. Големите луковички (с дължина над 1,5 см) се приспособяват най-добре - 99% от тях продължават успешно да се развиват. Луковички със средни размери (05-1,5 см) оцеляват до 60%, докато най-малките (под 0.5 см) имат около 20% преживяемост. Тези резултати са в съответствие с получените за Pancratium maritimum L.( Dragassaki et al., 2003).
2.4. Създаване на ген-банка от блатно кокиче
Създаването и поддържането на ген-банка от блатно кокиче (L. aestivum L.), включваща по 20 образци от 30 естествени находища в България е от голямо значение, разгледано в различни аспекти – научни и икономически.
Субкултивирането на растенията на всеки 60 дни и поддържането им при in vitro условия за 20 пасажа, с последващо адаптиране в почва, ни позволи да определим оптималните условия за запазване на генетичната идентичност на вида (фиг. 5).
Фиг. 5 Фази при създаване и поддържане на ген-банка от блатно кокиче.
Ген-банката (включваща 600 образци от блатно кокиче) ни дава възможност да продължим и задълбочим научните изследвания върху вида, които са насочени към проучване на генетичните фактори, влияещи върху синтезата на галантамин, които не са обект на настоящата дисертация.
След задълбочени изследвания на тези фактори ще бъдем в състояние бързо да възпроизвеждаме луковички от популации с високо съдържание на галантамин и възможност за създаване на промишлени насаждения.
2.5.1 Изпитване влиянието на различни въглеродни източници върху галантаминовото съдържание в in vitro култури.
Изследванията показват, че захарозата може да повлияе върху вторичния метаболизъм в клетъчни и органни култури (Fowler, 1983; Paiva and Janick, 1983). Резултатите от повечето изследвания водят до заключението, че повишаването на захарозата в известни граници води до повишаване на алкалоидната продукция в тъканни култури от различни растения (Merillon et al., 1984; Wijnsma et al., 1986; Duraz et al., 1994 Vázquez-Flota et al.,1994). По-малко данни има за ефекта на други въглеродни източници. Според Paiva and Janick, (1983) повишаването на захарозата, но не и на глюкозната концентрация повлиява съдържанието на липиди, антоциани и алкалоиди при зиготни и соматични ембрия от Theobroma cacao, отглеждани in vitro. Има данни, според които наличието на малтоза в хранителната среда също повишава натрупването на вторични метаболити (Kinnersle and Henderson, 1988; Rao and Narasu, 1999)
В настоящото проучване, количеството на галантамин за всеки вариант е измерено в средна проба от няколко експланта.
Наблюдава се обратна корелация между количеството въглехидрат в средата и натрупването на галантамин в експлантите, за разлика от резултатите, получени от Sellés et al., 1997 в подобен експеримент с нарцисови култури. Най-голямо количество на галантамин е измерено в експланти отглеждани без въглероден източник (779.08 μg/gDW). Във всички останали случаи количеството е в пъти по-малко. При вариантите с глюкоза, галантаминът намалява с повишаване на концентрацията. При вариантите с малтоза и захароза се наблюдава известно повишаване при най-високите им концентрации (фиг. 6)
Фиг. 6 Зависимост между галантаминовото съдържание и вида и количеството на използвания въглехидрат в хранителната среда.
2.5.2 Анализиране съдържанието на алкалоиди в in vivo и in vitro луковици от различни популации чрез GC-MS
Анализирани са 34 луковични екстракти от 18 популации и 10 екстракта получени от in vitro материал на 8 различни популации чрез GC/MS метод.
Мас-спектралния анализ показа общо 19 амарилисови алкалоиди в луковици и in vitro shoot-clumps култури (табл.4). Идентифицираните вещества принадлежат към галантаминовия (3-10), ликориновия (15, 19), хемантаминовия (13, 14) и хомоликориновия (11, 12, 16-18) тип алкалоиди. Освен това са намерени и тираминов тип протоалкалоиди (1, 2).
Веществата 1, 2 и 4 не са съобщавани за Leucojum aestivum от други автори.
Алкалоидни профили на луковици от L. aestivum събрани от естествените им находища
Поради съобщени онтогенетични и органоспецифичните вариации на алкалоидите в растенията (Стефанов, 1989; Elgorashi et al., 2002), в нашите експерименти са използвани само луковици във фаза на покой, което позволява растителния материал да бъде в една и съща онтогенетична фаза. Броят на алкалоидите, открити в проби от различни луковици варират значително, от 2 до 12 вещества. В алкалоидните профили на луковици от блатно кокиче, преобладават вещества от галантаминов и ликоринов тип вещества. Както може да се очаква, в луковиците са открити главно галантамин, епиноргалантамин, нарведин и ликорин. Установено е, че унгиминоринът присъства в много популации. Наблюдават се и значителни разлики в съотношенията между отделните алкалоиди в алкалоидните фракции на всяка популация. Галантаминът е доминаниращо вещество в повечето луковици с изключение на пробите от популацията в Чернозем. Той представлява повече от 50 % от всички алкалоиди, като стига до 98 % в пробите от популацията в Присад. Процентът на ликорин също варира в широки граници – от следи до 50% от общото алкалоидно съдържание в проба КШ1 (Кошарица).
В сравнение с останалите проби, тези от Чернмозем се различават значително по типове алкалоиди и алкалоиден профил (табл. 4)
Галантаминовото съдържание в луковиците варира в широки граници – от 28 до 2104 µg/g сухата маса.
Алкалоидни профили в in vitro получени растения
В in vitro култури от L. aestivum са идентифицирани шест алкалоида (табл.4). Основните са и галантамин и ликорин, докато останалите вещества присъстват като следи. Трябва да се отбележи, че някои от културите, получени in vitro продуцират главно галантамин, докато други натрупват ликорин като основно вещество. Освен това, 2-те проби от in vitro клонът с произход Присад показват значителна разлика в алкалоидните си профили. Едната продуцира основно галантамин (почти 100 % от общите алкалоиди, проба ПРiv2), а в другата е открит най-много ликорин (58 % от общата алкалоидна фракция, проба ПРiv1). Алкалоидните профили на in vitro пробите от Свиленград и Вельов вир са идентични с профилите им от естествените находища. При пробите от популация Бисер не се наблюдава подобна корелация (табл.4).
Съдържанието на галантамин при in vitro експланти варира от следи до 454 µg/g. Натрупването на това вещество в интактните растения и тези получени in vitro е в съответствие с публкикуваните от други автори данни за блатното кокиче (Стефанов, 1989; Diop et al., 2006).
Diop et al. (2006) изучават вариациите в натрупването на галантамин в експланти от блатно кокиче, отглеждани върху хранителна среда с различни комбинации растежни регулатори. Те откриват значителни разлики в съдържанието на този алкалоид при експланти, които те са получили, но те не определят нивата на други алкалоиди в тях. Нашите резултати показват също вариации в галантаминовото съдържание в in vitro култури, получени от различни популации на блатно кокиче, но поддържани на една и съща хранителна среда (само 1 комбинация от растежни регулатори). Освен това, резултатите от GC-MS анализа показват, не само вариране в галантаминовото съдържание, но и в алкалоидния профил на in vitro култури, получени от различни генотипове. Освен количеството на галантамин, алкалоидният профил също е важен показател, който може да се използва за оптимизиране на средата и условията на култивиране за манипулиране на биосинтетичния път на in vitro културите и получаване на специфични алкалоидни профили.
Табл.4. Алкалоиди, идентифицирани в блатно кокиче. Стойностите на отделните алкалоиди са в процент от тоталния алкалоиден извлек.
Код на пробатаe
|
галантамин
(μg/g DW)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
13
|
14
|
15
|
16
|
17
|
18
|
19
|
Метилтирамин
|
Хорденин
|
Галантамин
|
Сангвинин
|
Ликорамин
|
Епиноргалантамин
|
Галантаминов тип алкалоид
|
Ликораминов изомер
|
Епигалантамин
|
Нарведин
|
Хомоликоринов тип алкалоид
|
Хомоликоринов тип алкалоид
|
Хемантамин
|
11Хидроксивитаттин
|
Ликорин
|
Хомоликорин
|
8-O-Деметилхомо-
ликорин
|
Хипеастрин
|
Унгиминорин
|
Индекси на задържане
|
1456
|
1464
|
2404
|
2422
|
2423
|
2442
|
2445
|
2453
|
2454
|
2483
|
2501
|
2508
|
2633
|
2705
|
2743
|
2765
|
2817
|
2890
|
2901
|
СВ
|
270
|
|
tr
|
51.8
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
40.3
|
|
|
|
7.9
|
БС1
|
844
|
|
|
68.8
|
|
|
3.0
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
28.1
|
|
|
|
0.1
|
БС2
|
504
|
|
|
65.8
|
|
|
1.6
|
|
|
|
2.8
|
|
|
|
|
29.4
|
|
|
|
|
ЛБ1
|
704
|
|
|
67.4
|
|
|
5.8
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
1.0
|
|
|
|
26.4
|
ЛБ2
|
843
|
|
|
66.5
|
|
|
4.1
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
23.8
|
|
|
|
5.8
|
ГР1
|
1148
|
|
|
87.3
|
|
|
3.2
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
8.7
|
|
|
|
0.8
|
ГР2
|
686
|
|
|
91.4
|
|
|
8.6
|
|
|
|
|
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
ГЦ1
|
477
|
|
|
61.0
|
|
|
3.3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
35.5
|
|
|
|
|
ГЦ2
|
714
|
|
|
57.7
|
|
|
3.0
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
39.3
|
|
|
|
|
ВН1
|
1327
|
|
|
86.1
|
|
|
3.5
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
tr
|
10.4
|
|
|
|
|
ВН2
|
1326
|
|
|
95.0
|
|
|
4.0
|
|
|
|
0.5
|
|
|
|
|
0.4
|
|
|
|
|
OС1
|
1788
|
|
|
86.6
|
1.56
|
|
3.0
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
7.1
|
|
|
|
1.3
|
OС2
|
1212
|
|
|
78.5
|
|
|
3.5
|
|
|
|
0.3
|
|
|
|
|
16.7
|
|
|
|
|
КЧ1
|
2104
|
|
|
95.6
|
|
|
3.0
|
|
|
|
1.4
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
КЧ2
|
940
|
tr
|
tr
|
67.7
|
|
|
2.6
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
21.0
|
|
|
|
8.7
|
КШ1
|
399
|
|
|
48.3
|
|
|
1.8
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
50.0
|
|
|
|
tr
|
АР1
|
805
|
|
|
82.9
|
|
|
4.5
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
9.6
|
|
|
|
3.0
|
АР2
|
1118
|
|
|
96.3
|
|
|
3.2
|
|
|
|
0.5
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВВ1
|
1336
|
|
|
99.3
|
|
|
0.2
|
|
|
|
0.5
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВВ2
|
883
|
|
|
95.9
|
|
|
3.4
|
|
|
|
0.5
|
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
СЗ1
|
276
|
tr
|
tr
|
58.6
|
|
|
3.1
|
|
|
|
|
|
|
|
|
32.6
|
|
|
|
5.8
|
СЗ2
|
705
|
|
|
76.7
|
|
|
2.7
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
|
10.5
|
|
|
|
10.1
|
ЛЗ1
|
1034
|
|
|
92.5
|
|
|
3.2
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4.2
|
|
|
|
|
ЛЗ2
|
424
|
|
|
93.4
|
|
|
3.3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3.3
|
|
|
|
|
ЧЗ1
|
28
|
|
|
4.0
|
|
18.8
|
|
9.6
|
tr
|
|
1.7
|
7.5
|
7.4
|
34.6
|
|
|
2.3
|
3.3
|
10.8
|
|
ЧЗ2
|
31
|
|
|
5.1
|
|
10.6
|
|
6.6
|
tr
|
|
1.5
|
8.0
|
6.7
|
31.5
|
|
tr
|
5.7
|
5.5
|
19.0
|
|
ПР1
|
1462
|
tr
|
tr
|
97.6
|
|
|
1.7
|
|
|
|
0.6
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ПР2
|
1066
|
|
|
98.0
|
|
|
2.0
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ЯМ1
|
1190
|
|
|
76.7
|
|
|
0.9
|
|
|
|
|
0.5
|
|
|
|
21.9
|
|
|
|
|
ЯМ2
|
1062
|
|
|
78.3
|
|
|
2.3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
19.4
|
|
|
|
|
БЛ1
|
339
|
|
|
69.5
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
30.5
|
|
|
|
|
БЛ2
|
409
|
|
|
69.3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
30.8
|
|
|
|
|
ПЛ1
|
895
|
|
|
90.9
|
|
|
8.4
|
|
|
|
0.8
|
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
ПЛ2
|
352
|
|
|
73.6
|
|
|
11.7
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
14.7
|
|
|
|
|
СВiv
|
169
|
|
|
32.9
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
77.1
|
|
|
|
|
БСiv
|
350
|
|
|
100
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ЛБiv
|
25
|
|
|
100
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
АРiv
|
454
|
|
|
100
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
АРsiv
|
335
|
|
|
100
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВВiv
|
143
|
|
|
100
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
СЗiv
|
tr
|
|
|
tr
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ЛЗiv
|
346
|
tr
|
|
84.9
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
15.9
|
|
|
|
|
ПРiv1
|
82
|
tr
|
|
41.2
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
58.9
|
|
|
|
|
ПРiv2
|
57
|
|
|
100
|
|
|
tr
|
|
|
|
tr
|
|
|
|
tr
|
tr
|
|
|
|
|
|