Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010

Для определения родственных взаимоотношений и уточнения таксономического статуса, а также выявления филогенетических взаимосвязей видов рода Linum L. проведено изучение геномов возделываемого Linum usitatissimum L. и 25 дикорастущих видов из 6 секций [Юзепчук, 1949; Егорова, 1996], в основном произрастающих в Евразии.

Род Linum – лен включает около 200 видов, которые разделяют на 5-6 секций [Юзепчук, 1949; Ockendon, Walters, 1968; Егорова, 1996]. Кариологическое изучение видов льна начато более полувека назад, и почти у 30 видов Нового и 50 видов Старого Света были определены хромосомные числа. Показано, что в кариотипах льновых число хромосом варьирует от 12 до 84. Однако, у многих видов льна числа хромосом, определенные разными исследователями, различались. Даже в кариотипе наиболее хозяйственно важного возделываемого вида L. usitatissimum L. насчитывали два числа хромосом 2n = 30 и 2n = 32. Хромосомы у льнов имеют сходную морфологию (в основном это метацентрики), и их размеры колеблются от 1 мкм до 6 мкм [Ray, 1944; Болховских и др.,, 1969; Rogers и др., 1972; Chennaveeraiah, Joshi, 1983].

При изучении кариотипов видов из 6 секций рода Linum L. нами впервые установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. thracicum Degen. (2n = 28+1-6B) и L. czernjajevii Klokov (2n = 28+1-6B); уточнены хромосомные числа у L. decumbens Desf. ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch. (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). На основании исследований кариотипов 22 долгунцовых и масличных сортов льна, а также межеумков было подтверждено, что число хромосом у L. usitatissimum – 2n = 30.

До настоящего исследования ни у одного вида льна по результатам монохромного окрашивания в кариотипе не были идентифицированы пары гомологов. В результате дифференциального окрашивания в хромосомах всех изученных видов были выявлены С/DAPI-бэнды, самые крупные из которых располагались преимущественно в прицентромерных районах, а средние и небольшие – в теломерных и интеркалярных районах хромосом. На хромосомах всех изученных видов были локализованы пробы 26S и 5S рДНК. В геномах большинства видов льнов обнаружены 1-2 основных локуса 26S рДНК, ко-локализованные с 5S рДНК, а также 1-3 отдельных локуса 5S рДНК. Исключение составили два вида секции Linopsis (syn.= Linastrum), в геномах которых 5 из 9 пар хромосом несут сайт 26S рДНК и одна – 5S рДНК. На основании изучения морфологии хромосом, рисунков С/DAPI-окрашивания и результатов FISH-анализа удалось провести полную идентификацию хромосом в кариотипах всех исследованных видов. В кариотипах видов секции Syllinum впервые были выявлены и охарактеризованы В-хромосомы.

В кариотипах видов секции Syllinum: L. flavum L., L. capitatum Kit. еx Schultes, L. campanulatum L., L. thracicum Degen, L. tauricum Willd, L. elegans Sprun. ex Boiss., L. czerniajevii Klokov нами были обнаружены добавочные хромосомы (В-хромосомы), число которых варьировало в клетках корневой меристемы от 1 до 6, а у некоторых растений эти хромосомы отсутствовали вовсе.

Установлено, что В-хромосомы в кариотипах исследованных видов имеют сходную структуру. В подавляющем большинстве случаев они представляют собой субметацентрики длиной около 1 мкм, и являются самыми маленькими хромосомами в наборе. Они гетеропикнотичны, интенсивно окрашиваются DAPI и СМА (Рис. 26-III), содержат множественные сайты 5S и 26S рДНК (Рис. 26-IV), которые не проявляют функциональной активности (Рис. 26-II). В- хромосомы с такой морфологией мы назвали "основным м
орфологическим типом" (Рис. 26-IV).
Рис 26. В-хромосомы видов секции Syllinum. I – С-окраска хромосом и ядра L.flavum; II – Ag-ЯОР-окрашивание профазных хромосом L.flavum (а) и его совмещение с последующим DAPI-окрашиванием (б); III – CMA-окрашивание В-хромосом в профазе (а), ядре (б) и сравнение рисунков окраски CMA и DAPI метафазных В-хромосом; IV – основной морфологический тип В-хромосом у разных видов, представлено инвертированное изображение DAPI-окрашивания и рядом та же хромосома с локализацией 26S рДНК (зеленый сигнал) и 5S рДНК (красный сигнал); V – иногда встречаемые атипичные В-хромосомы (а) и ассоциации В-хромосом (б).
Иногда встречаются другие морфологические типы В-хромосом – метацентрики и мелкие акроцентрики (Рис. 26-Vа). Возможно, что такие "атипичные" хромосомы образуются из В-хромосом основного типа в результате хромосомных перестроек. В некоторых метафазных пластинках обнаружены В-хромосомы, объединённые в кластеры, напоминающие по форме грозди винограда (Рис. 26-Vб). Следует отметить, что хотя по размеру и рисунку DAPI-бэндинга В-хромосомы иногда бывает трудно отличить от самых мелких хромосом постоянного набора (А-хромосом), наличие генов рибосомных РНК в В-хромосомах позволяет надежно их идентифицировать. Исследование В-хромосом у видов секции Syllinum позволило точно установить число А-хромосом в их кариотипах (2n = 28).
2.6.3. Сравнительные молекулярно-цитогенетические исследования видов льна.

Все исследованные виды льнов были разделены на 8 групп на основании сходства их кариотипов. Виды, объединенные в одну группу, имели сходную структуру кариотипов, а межвидовые различия, выявленные по рисунку С/DAPI-окраски хромосом и расположению рибосомных генов, были представлены небольшим числом реципрокных хромосомных транслокаций или перицентрических инверсий. В то же время, кариотипы видов, входящих в разные группы, значительно отличались друг от друга как по размерам, числу хромосом и рисункам их дифференциального окрашивания, так и по числу и расположению на хромосомах рДНК локусов. Кариограммы и идиограммы одного из видов, принадлежащих к каждой группе представлены на рисунке 27.

Первую группу составили виды с 2n = 18 из секций Adenolinum и Stellerolinum. Хромосомы вида L. stelleroides Planch., который систематики выделяют в монотипную секцию Stellerolinum Juz. ex Probat. [Юзепчук, 1949], по рисунку С/DAPI-окраски и расположению рибосомных генов оказались схожими с видами из секции Adenolinum (L. austriacum subsp. austriacum L., L. austriacum subsp. еuxinum Juz. (=L. squamulosum Rudolphi), L. leonii F.W. Schultz, L. perenne L., L. lewisii Pursh., L. komarovii Juz., L. altaicum Ledeb., L. mesostylum Juz., L. pallescens Bunge.). По-видимому, морфологические и анатомические отличия видов этих секций обусловлены различиями их геномов на молекулярном уровне, не детектируемыми цитогенетическими методами.

Секция Linum разделилась три группы с 2n = 30, 2n = 16 и 2n = 28. Следует отметить, что близкородственные 30-хромосомные виды L. usitatissimum L. и L. bienne Mill. отличаются от L. angustifolium Hunds. перицентрической инверсией хромосомы 3. Эти виды и виды L. grandiflorum Desf. и L. decumbence Desf. с 2n = 16 секции Linum, хотя и различаются плоидностью, но похожи по рисункам С/DAPI-окраски многих хромосом набора и расположению рибосомных генов. Высокое сходство рисунков С/DAPI-бэндинга наблюдается также между этими видами секции Linum и видами секций Adenolinum и Stellerolinum. При этом кариотипы последних, по нашим данным, отличаются от 16-хромосомных видов по наличию, по крайне мере, одной транслокации и дупликации по хромосоме 8. Таким образом, результаты хромосомного анализа подтверждают общность происхождения вышеуказанных видов секций Linum, Adenolinum и Stellerolinum.

Как уже говорилось выше, обнаружение в кариотипах видов L. flavum, L. capitatum, L. campanulatum, L. thracicum, L. tauricum, L. elegans, L. czerniajevii секции Syllinum В-хромосом, позволило установить, что число хромосом в основном хромосомном наборе этих видов равно 28. Обнаружено, что основные А-хромосомные наборы всех этих видов сходны по размерам хромосом, рисунку C/DAPI бэндинга и локализации рДНК. У двух видов L. capitatum и L. czerniajevii выявлено по одной реципрокной транслокации хромосом.

Особняком от остальных видов секции Syllinum стоит 26 хромосомный вид L. nodiflorum L. Хромосомы этого вида имеют значительно меньшие размеры по сравнению с хромосомами других видов этой секции, В-хромосом у этого вида не обнаружено. Кроме того, L. nodiflorum отличается от других видов секции по расположению и количеству локусов генов рибосомных РНК. Следует, однако, отметить, что, несмотря на различия в размерах, хромосомы L. nodiflorum схожи с хромосомами других видов секции по рисунку С/DAPI-бэндинга. Последнее указывает на то, что L. nodiflorum имеет все же отдаленное родство с 28-хромосомными видами секции. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа позволяют предположить, что в процессе формирования кариотипа L. nodiflorum имело место по крайней мере одно хромосомное слияние. Выявленные геномные отличия L. nodiflorum от других видов секции Syllinum хорошо согласуются с мнением некоторых систематиков о необходимости выделения этого вида в отдельную секцию Tubilinum [Светлова, 2006].

Две отдельные группы составляли виды секций Dasilinum и Linopsis. Кариотип L. hirsutum L. subsp hirsutum секции Dasylinum состоит из 16 хромосом, имеющих самые крупные размеры среди льновых. По рисункам С/DAPI-бэндинга и расположению рибосомных генов хромосомы этого вида схожи с отдельными хромосомами L. narbonense, L. nodiflorum и видов из секции Linopsis.

Кариотипы L. suffruticosum L. subsp. salsoloides (Lam.) Rouy. и L. tenuifolium L. секции Linopsis (syn. Linastrum) представлены 9 парами сходных по рисункам С/DAPI-бэндинга хромосом. Эти виды различаются по наличию транслокации между хромосомами, несущими гены рРНК. Поэтому у L. tenuifolium на одной из 5 спутничных хромосом в разных плечах расположены сайт ко-локализованных 26S и 5S рДНК и отдельный сайт 5S рДНК. Таким образом, у этих видов представлены практически все морфологические типы хромосом, несущих гены рРНК, которые имеются у видов из других секций.

Параллельно с комплексным хромосомным анализом для этих же видов льна был проведен анализ геномного полиморфизма с помощью высокоразрешающнго метода RAPD-PCR в полиакриламидном геле. В результате была построена UPGMA-дендрограмма геномной близости видов рода Linum (Рис. 28).

Р
ис. 28. Дендрограмма генетической близости видов различных секций рода Linum L., построенная по результатам RAPD-анализа.

П
редполагается, что предковая форма рода Linum (Protolinum) могла иметь основное число хромосом равное 8 или 9. Эти числа встречаются у диплоидных видов рода, отнесенных к разным филогенетическим ветвям. Виды секций Adenolinum, Stellerolinum и Linopsis имеют n = 9, а виды секции Linum, Dasylinum и Cathartolinum имеют n = 8.

Ранее на основании анализа кариотипов при монохромном окрашивании хромосом было построено предполагаемое эволюционное древо рода Linum, в основание которого был помещен диплоидный вид c основным числом хромосом n = x = 9 [Chennaveeraiah and Joshi, 1983]. Если предположить, что исходным было число хромосом n = x = 8, то оказывается, что редукция хромосомных чисел имела место только у полиплоидных видов льна (n = 13, 14, 15), а диплоидные виды с n = 9, 10 могли возникнуть вследствие хромосомных дупликаций. На наш взгляд это наиболее простое объяснение изменчивости основного числа хромосом у льнов (Рис. 29).

Как показало проведенное нами кариологическое исследование, в процессе видообразования льновых происходила полиплоидизация, различные хромосомные перестройки, в частности, хромосомные слияния, а также могла иметь место полисомия и утрата хромосом полиплоидами, что и привело к существующему разнообразию хромосомных чисел у видов рода Linum. Поэтому в настоящий момент не представляется возможным достоверно установить, какое именно основное хромосомное число было исходным у льнов. Возможно, что это число было даже более низким, чем у ныне живущих диплоидных видов. В связи с этим следует упомянуть, что на основании недавно проведенного молекулярно-филогенетического исследования последовательностей внутренних нетранскибируемых спейсеров генов 45S рРНК и нескольких генов генома хлоропластов, было высказано мнение, что род Linum не является монофилетическим [McDill et al., 2009]. Если это действительно так, то единого для рода Linum исходного хромосомного числа может и вовсе не существовать.

Таким образом, сравнительное молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. В то же время обнаружено, что систематика рода не вполне совершенна, и хочется надеяться, что полученные нами результаты помогут уточнить таксономию рода Linum L.

В работе представлен комплекс методов, позволяющих осуществлять детальное изучение хромосомной организации геномов растений, включая надежную идентификацию малоинформативных (небольшие размеры и/или бедность рисунков С-окраски) индивидуальных хромосом. Использование метода выявления рисунков ранней репликации хромосом открывает широкие возможности не только для идентификации хромосом, но и для более глубокого исследования последовательности репликации ДНК у растений. Применение ДНК-интеркаляторов тормозит процесс конденсации митотических хромосом, что приводит к повышению разрешающей способности дифференциального окрашивания и FISH с различными маркерными последовательностями ДНК. Оптимизация программно-аппаратного комплекса регистрации и анализа изображений значительно облегчает, ускоряет и делает более объективными исследования хромосомной организации геномов растений даже с очень мелкими хромосомами. Четкая идентификация индивидуальных хромосом на препаратах, полученных с помощью щадящих структуру ДНК процедур, может служить в качестве кариологической основы при осуществлении проектов тотального секвенирования геномов хозяйственно-ценных мелкохромосомных растений, поскольку открывает возможность получать хромосомо- и локус-специфические клонотеки с помощью микродиссекции и способствовать созданию генных контигов различной протяженности.

1. 
   Разработан комплекс цитогенетических методов (выявление рисунка ранней репликации хромосом растений, задержка конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА, OR-бэндинг, Q-подобный DAPI-бэндинг и применение новых флуоресцентных лигандов, созданных на базе красителя Hoecht, - DB(8) и DB(17), для получения высококонтрастного флуорохромного бэндинга), и повышающий разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
   
2. 
   Показано, что FISH-картирование универсальных молекулярных зондов (рДНК, теломерный повтор) не только облегчает идентификацию хромосом и выявление хромосомных перестроек в кариотипах растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга, но и дает возможность более точно устанавливать взаимотношения родственных геномов. Для растений с небольшими геномами и мелкими хромосомами FISH-картирование геномной ДНК или ее фрагментов из геномных библиотек перспективно для получения дополнительных маркеров, позволяющих проводить успешную идентификацию их хромосом.
   
3. 
   Применение последовательно или одновременно нескольких молекулярно-цитогенетических методов в сочетании с оптимизацией программно-аппаратного комплекса получения и анализа изображений значительно расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
   
4. 
   По рисункам ранней репликации идентифицированы 13 пар гомологов в геноме A₁ диплоидного хлопчатника G. herbaceum и 26 пар - в геноме (AD)₂ аллотетраплоидного хлопчатника G. barbadense. Хромосомы генома (AD)₂ были разделены на субгеномы A_b и D_b. Сходство рисунков ранней репликации не только в A₁ и A_b геномах, но и в D_b геноме свидетельствует о консервативности последовательности репликации ДНК в родственных геномах.
   
5. 
   С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей. Показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta). Обнаружено, что изученные виды, относящиеся к наиболее примитивным эукариотам, обладают и практически самыми малыми геномами, что демонстрирует зависимость хромосомной организации генома, от его размера.
   
6. 
   Cравнительное исследование хромосом по рисункам С- и OR-бэндинга в кариотипах трех сортов ромашки аптечной ( M. chamomilla L.) показало, что они различались по полиморфизму С-блоков и не различались по рисункам OR-бэндинга. По сходству рисунков С-окраски хромосом обнаружено, что дикорастущий вид M. inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом M. maritima , который был обозначен M_m. Его сравнение с M_ch-геномом ромашки аптечной выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности их происхождения.
   
7. 
   По рисункам OR-бэндинга, С/DAPI-бэндинга, распределению на хромосомах рибосомных генов и теломерного повтора, а также их активности, проведено сравнительное исследование кариотипов 8 сортов и 4 линий гороха посевного. RAPD-анализ обнаружил деление их на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. Продемонстрировано, что даже небольшие специфические особенности геномов сортов и линий гороха могут служить основой для их идентификации. C помощью высокоразрешающего DAPI-бэндинга проведено точное картирование разрывов в хромосомах транслокационных линий гороха M-10 и L-108.
   
8. 
   Сравнительное исследование геномов двухромосомных видов злаков Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.
   
9. 
   По рисункам С/DAPI-бэндинга и расположения генов рРНК идентифицированы все хромосомы; составлены кариотипы и построены идиограммы хромосом в геномах рода линум L. У видов секции Syllinum впервые охарактеризованы В-хромосомы, что позволило уточнить число А-хромосом (2n=28) в их кариотипах.
   
10. 
    По результатам анализа кариотипов 26 видов льнов из секций Linum Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum, Syllinum и Linopsis рода Linum разделились на 8 групп. Внутри этих групп виды различались по хромосомным перестройкам и плоидности. Результаты RAPD-анализа хорошо согласовались с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов льной, имеющие сходную структуру кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно.
    
11. 
    Подтверждена таксономическая обособленность секций Adenolinum, Dasylinum, Linopsis и Tubilinum. Не обнаружено различий видов секций Stellerolinum и Adenolinum. Виды секции Linum разделились на три геномных группы, что позволяет использовать кариотип как дополнительный таксономический признак при уточнении сложного систематического статуса этой секции.
    
12. 
    Молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. Обнаружено, что секции Linum, Adenolinum и Stellerolinum имеют общего предка. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для начала тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.