Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010

Проведенное исследование показало, что у растений, так же как и у животных, рисунок репликации хромосом достаточно консервативен и может применяться для решения задач цитогенетики. Однако, несмотря на хорошее разрешение этого метода для анализа мелких хромосом растений, он имеет существенные недостатки, ограничивающие его применение. Метод довольно сложен в исполнении, требует длительной предобработки прорастающих корней раствором бромдезоксиуридина в высокой концентрации. При этом высокая митотическая активность корневой меристемы сохраняется только в условиях хорошей аэрации корней. Кроме того, использованный вариант BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинга не совместим с другими методами дифференциального окрашивания хромосом, а также с FISH, что очень важно при исследовании хромосомной организации геномов разных растений.

До нашего исследования митотические хромосомы в клетках автоспор одноклеточных красных водорослей с помощью микроскопического исследования обнаружить не удавалось. Использование 9-АМА позволило визуализировать митотические хромосомы одноклеточных красных водорослей Galdieria maxima, G. partita, G. sulphuraria и Cianidium caldarium в процессе формирования автоспор. Для этого была разработана методика, позволяющая одновременно обрабатывать культивируемые клетки водорослей 9-АМА и пепсином с целью размягчения белкового компонента клеточных стенок. Такой подход позволяет после фиксации клеток и окрашивания ацетоорсеином получить хорошие давленые препараты недоконденсированных митотических хромосом и провести их морфометрическое исследование.

В автоспорах всех трех видов Galdieria было обнаружено по две хромосомы длиной 0,8-2,3 мкм, причем одна из хромосом была на треть больше другой (Рис. 18).

Рис. 18. Хромосомные пластинки (а) и их контрастированное изображение (б): 1 – G. maxima, 2 – G. partita, 3 – G. sulphuraria, 4 – C. caldarium.

Масштабная линейка – 3 мкм.
Статистически значимые межвидовые различия размеров хромосом G. maxima, G. partita, G. sulphuraria могут быть использованы в качестве дополнительного признака при определении видовой принадлежности этих водорослей. Больше трудностей представлял подсчет числа хромосом в геноме C. сaldarium, поскольку размеры 5 видимых хромосом были от 0,4 до 0,7 мкм (Рис. 18). Иногда с трудом различались еще 2 точечных хромосомы, размеры которых были на грани разрешающей способности светового микроскопа.

На хромосомах всех изученных видов было трудно точно определить положение центромер. Возможно, что хромосомы этих водорослей относятся к голоцентрическому типу, характерному для некоторых зеленых водорослей. Полученные результаты позволяют использовать число хромосом в качестве таксономического признака для распознавания представителей родов Cianidium и Galdieria.

Определение содержания ядерной ДНК, проведенное на профазных ядрах, окрашенных по Фельгену, показало, что представители семейства Cyanidiасеае имеют самые маленькие из известных геномов у фотосинтезирующих эукариот – 1,5-2,25х10^-2 пкг ДНК в расчете на 1С (Табл.1).
Таблица 1. Средние значения суммарной длины хромосом и

количества ДНК в геномах красных микроводорослей.

Вид микроводоросли	Суммарная длина хромосом, мкмSE	Содержание ДНК на 1C, пкг 10-2SE
G.maxima	4.140.44	2.250.09
G.partita	2.820.49	1.560.06
G.sulphuraria	2.070.18	1.350.05
C. caldarium	2.610.06	1.490.03

SE – стандартная ошибка среднего значения.

Это хорошо объясняет как малые размеры хромосом, обнаружить которые при микроскопическом исследовании стало возможным только после применения 9-АМА, так и отсутствие дифференциального окрашивания хромосом у исследованных видов.

Таким образом, исследование хромосомной организации геномов четырех видов микроводорослей класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta) позволило не только установить их хромосомные числа и уточнить их систематическое положение, но и подтвердить наличие зависимости хромосомной организации генома от его размера.
2.3. Ромашка аптечная и родственные виды.

Исследование рисунков OR- и С-бэндинга хромосом (Рис. 19, 20) у двух диплоидных (Азулена и Сибирская бизаболольная) и одного автотетраплоидного (Подмосковная) сортов ромашки аптечной Matricaria chamomilla L. показало, что четкий рисунок OR-бэндинга выявляется на хромосомах ромашки размером 5,3-10,2 мкм. Это почти в 1,5 раза превышает длину хромосом, необходимую для получения С-бэндинга высокого разрешения и в 2 раза – длину метафазных хромосом, получаемых без использования 9-АМА (2,8-5,9 мкм).

На каждой хромосоме ромашки аптечной выявляется от 12 до 22 OR-бэндов. При этом центромерные районы, а также области вторичных перетяжек не окрашиваются. Сравнительное изучение рисунков OR-окраски хромосом у разных сортов ромашки обнаружило межсортовую консервативность этого типа бэндинга.
Рис. 19. С- (а) и OR- (б) окрашенные хромосомы M. chamomilla сорта Сибирская бизаболольная.
При изучении рисунков С-бэндинга в кариотипах тех же трех сортов ромашки аптечной выявлено, что они отличались большей контрастностью и наличием ряда дополнительных мелких интеркалярных С-блоков по сравнению с необработанными 9 АМА С-окрашенными хромосомами. По рисункам С-бэндинга проведена идентификация хромосом в кариотипах изученных сортов. Сорта различались в основном по размерам прицентромерных гетерохроматических районов, а также ряда небольших интеркалярных и теломерых С-бэндов на всех хромосомах, кроме 4 и 5. Хромосомы сорта Подмосковная в целом были более гетерохроматичны по сравнению с диплоидными сортами. Изучение рисунков С-бэндинга хромосом у этого сорта позволило подтвердить его автополиплоидное происхождение. Тем не менее, выявлены небольшие различия в рисунках С-окраски 2, 6 и 7 хромосом из разных субгеномов в кариотипе сорта Подмосковная. Геном ромашки аптечной был обозначен нами M_ch геном.

На основании оценки размеров хромосом, положения центромер и вторичных перетяжек было установлено соответствие результатов по идентификации хромосом, проведенной на основании рисунков OR- и С-окрашивания хромосом M_ch генома ромашки аптечной, и построены идиограммы (Рис. 20).

Применение 9-АМА позволило впервые изучить рисунки OR- и С-окраски хромосом 8 сортов гороха посевного (Pisum sativum L.), который имеет размеры хромосом, сходные с ромашкой. При С-окрашивании хромосом гороха выявляются небольшие прицентромерные и теломерные, а также мелкие интеркалярные С-бэнды. На основании оценки морфологии хромосом и рисунков С-бэндинга была проведена идентификация хромосом в геноме гороха в соответствии со стандартной цитогенетической номенклатурой Бликста (Рис. 21а) [Blixt, 1959].

Р
ис. 21. Кариотипы P. sativum L.: C- (а) и OR- (б) дифференциальное окрашивание хромосом. Компьютерное совмещение последовательно окрашенных хромосом ацетоорсеином (красный) и DAPI (синий) (в). 1-7 – номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой Бликста.

Рисунки С-бэндинга хромосом у сортов овощного, сахарного, кормового и зернового гороха различались по размерам прицентромерных и приспутничных гетерохроматических блоков, а также интеркалярных С-бэндов в коротких плечах 2, 3, 4 и 7 хромосом и в длинных плечах хромосом 1 и 5.

Четкий OR-бэндинг c большим числом темноокрашенных районов был выявлен на хромосомах тех же сортов гороха. По рисункам OR-окраски идентифицированы все хромосомы (Рис. 21б). Также как и С-окрашенные хромосомы, они были расположены по размерам и центромерному индексу в соответствии с номенклатурой Бликста. Было проведено последовательное (Рис. 21в) OR-, а затем С/DAPI-окрашивание (Рис. 21а и 22а) хромосом гороха, которое подтвердило правильность такого подхода при их идентификации. Межсортовых различий по рисункам OR-окраски не было выявлено.

При исследовании хромосом гороха было обнаружено, что на профазных и прометафазных хромосомах после предобработки 9-АМА и процедуры FISH выявляется Q-подобный DAPI-бэндинг. В зависимости от фазы митоза DAPI-бэндинг может быть различной степени разрешения. По мере компактизации хромосом Q-подобный DAPI-бэндинг переходит в С-подобный DAPI-бэндинг (C/DAPI-бэндинг) (Рис. 22а).

Это обстоятельство позволяет подобрать степень конденсации хромосом, при которой по рисунку DAPI-бэндинга возможно идентифицировать хромосомы и при необходимости локализовать на них точки хромосомных перестроек или ДНК-зонды. С помощью такого подхода была изучена структура кариотипов транслокационных линий L-108 и M-10 гороха. DAPI-бэндинг высокого разрешения позволил точно установить на профазных-прометафазных хромосомах точки разрыва хромосом при транслокациях (Рис. 22б). Для линии L-108 выявлены точки разрывов в проксимальных районах коротких плеч хромосом 2 и 7. Для линии М-10 впервые установлено наличие двойной транслокации между длинными и короткими плечами хромосом 2 и 4.

Сравнительное исследование рисунков DAPI-бэндинга хромосом у всех восьми сортов и 2 родственных линий (с высоким симбиотическим потенциалом) гороха, выявленных после FISH картирования рибосомных генов и теломерного повтора, обнаружило невысокий уровень внутри- и межсортового полиморфизма, подобно С-окраске (Рис. 23).

У всех изученных образцов гороха 26S рДНК находится в районах вторичных перетяжек и на спутнике 4 хромосомы и в приспутничном районе 7 хромосомы. Сайты 5S рДНК располагались на 1, 3 и 5 хромосомах, причем высокоразрешающее DAPI-окрашивание дало возможность уточнить районы локализации 5S рДНК. Теломерные повторы выявлялись на концах всех хромосом (см. раздел 1.3.1, рис. 6) как в нормальных, так и в транслокационных кариотипах. Дополнительных сайтов гибридизации с рДНК и теломерными последовательностями не выявлено (Рис. 23).

Ag-ЯОР-окрашивание показало, что в изученных образцах гороха оба локуса 26S рДНК, расположенные на хромосомах 4 и 7, функционально активны. В линиях гороха, несущих транслокации по ЯОР-образующим хромосомам 4 и 7, изменений функциональной активности ЯОР в этих хромосомах не обнаружено.
Рис. 23. Хромосомы гороха сорта Frisson: а - С-бэндинг, б - FISH-картирование 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК, в - идиограмма хромосом с указанием расположения С/DAPI-бэндов (черный), 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК 1-7 – номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой [Blixt, 1959; Fuchs et al., 1998].
Исследование геномного полиморфизма у изученных сортов и линий гороха методом RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле с 3 информативными праймерами А06, А09 и А10 в выявило между ними различия по 45 полиморфным локусам. RAPD-спектры всех исследованных представителей сорта или линии делились на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. В кластерах линии Sprint 2 и сорта Finale обнаружен геномный полиморфизм между изученными индивидуальными растениями. Полученные нами результаты подтверждают возможность применения RAPD-анализа для идентификации сортов гороха [Гостимский и др., 2005].

Таким образом, значительных кариотипических различий исследованных сортов и линий гороха выявлено не было. Тем не менее, даже небольшие специфические особенности их геномов могут служить основой для создания кариогеномного паспорта. Такой подход может быть особенно важен для сертификации определенного генотипа гороха посевного при создании новых сортов и проверке чистоты суперэлитного и элитного семенного материала.

Наряду с исследованием мелкохромосомных видов нами были изучены дикорастущие злаки, с числом хромосом кратным 2 – Z. biebersteiniana (Claus) P. Smirn. (2n = 4) и Z. pisidica (Boiss.) Tutin (2n = 8), Colpodium versicolor (Stev.) Schmalh. (2n = 4) с целью изучения формирования и происхождения их уникальных двухромосомных геномов. Сложность исследования хромосом этих растений была связана с тем, что, несмотря на довольно крупные размеры хромосом (8-11 мкм), две пары хромосом цингерии не всегда легко идентифицируются по размерам и морфологии, особенно в случае отсутствия выраженных вторичных перетяжек, а рисунок С-бэндинга у них беден и поэтому малоинформативен. При С-окрашивании хромосом Zingeria biebersteiniana четко выявляются только крупные С-бэнды в прицентромерных районах хромосом, а интеркалярные и прителомерные С-бэнды имеют очень маленькие размеры и выявляются нерегулярно (Рис. 23а). Следует отметить, что по рисункам С-бэндинга идентификация хромосом цингерии не составляет труда, но сравнение хромосом близкородственных видов значительно затруднено ввиду плохой выраженности интеркалярных С-бэндов. Это обстоятельство выдвинуло на первый план задачу поиска дополнительных хромосомных маркеров, позволяющих детально исследовать структуру хромосом двухромосомных злаков.

Применение 9-АМА позволило выявить на недоконденсированных хромосомах длиной 11-15 мкм чёткий рисунок OR-бэндинга (Рис. 23б).
Рис. 24. Кариограммы и идиограммы цингерии: а -C- бэндинг и б - OR- бэндинг. 1 и 2 – номера хромосом.
По сравнению с С-окраской рисунок OR-бэндинга в хромосомах цингериии представлен большим числом интеркалярных бэндов. При этом С-позитивные прицентромерные районы хромосом, а также области вторичных перетяжек ацеторсеином не прокрашиваются.
2.5.2. Происхождение двухромосомных злаков Zingeria и Colpodium.

Для установления путей происхождения уникальных двухромосомных геномов злаков проведено сравнительное исследование хромосом в кариотипах Z.biebersteiniana (2n = 4), Z. pisidica (2n = 2х = 8), Colpodium versicolor (2n = 4) и Catabrosella variegata (syn.= Colpodium variegatum) (2n = 10). Метод С-дифференциального окрашивания выявляет на хромосомах этих видов малоинформативные рисунки, тем не менее, в кариотипах двух образцов Z. bibersteiniana из разных мест произрастания обнаружен межпопуляционный полиморфизм С-блоков хромосом. В частности, хромосомы растений, собранных вблизи лимана Пришиб в Волгоградской области, содержат более крупные прителомерные и интеркалярные С-блоки по сравнению с хромосомами растений, выросших в окрестностях с. Рахинка той же области.

Сравнительный анализ геномов C. versicolor и Z. biebersteiniana показал, что они сходны по морфологии и характеру распределения интеркалярных С-блоков по одной из хромосом, тогда как по другой (ядрышкообразующей) хромосоме различаются по центромерному индексу, положению вторичных перетяжек и рисунку С-окрашивания.

Установлено, что две пары хромосом из четырех в кариотипе Z. pisidica имеют значительное сходство с хромосомами Z. biebersteiniana. Однако, в отличие от Z. biebersteiniana, хромосомы Z. pisidica не содержат крупных прицентромерных С-блоков. Две другие хромосомы по рисункам С-окраски сходны с хромосомами C. versicolor. Однако размеры отдельных интеркалярных С-блоков у Z. pisidica значительно крупнее, чем таковые в хромосомах C. versicolor (Рис. 25). По-видимому, один из субгеномов Z. pisidica и геном Z. biebersteiniana имеют общее происхождение. Не исключено, что предковый геном C. versicolor принимал участие в формировании другого субгенома Z. pisidica.

У исследованных видов проведена хромосомная локализация генов 45S и 5S рРНК. Рисунки расположения генов 45S и 5S рРНК на хромосомах двух видов цингерий и у C. versicolor подтверждают предположение, что Z. pisidica является аллотетраплоидом, у которого один из субгеномов сходен с геномом Z. biebersteiniana (Рис. 24). Сравнение кариотипов Catabrosella variegata и описанных выше видов злаков не выявило черт сходства между ними.

Проведено сравнение последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК в геномах изученных видов. Обнаружено, что геномы уникальных двухромосомных злаков (x = 2) – Z. biebersteiniana (2n = 4), Z. pisidica (2n = 2х = 8) и Colpodium versicolor (2n = 4), относимые ранее к разным трибам или подтрибам, представляют два близких рода, генетическое расстояние (p-distance) между ITS которых составляет всего 1,2–4.4%. На молекулярно-филогенетическом древе виды Zingeria и Colpodium versicolor образуют единую кладу с Catabrosella araratica (2n = 42, x = 7).

Таким образом, установлено, что геномы Zingeria и Colpodium с наиболее низким из известных основным числом хромосом (x = 2) возникли не в разных филогенетических ветвях, а имеют монофилетическое происхождение.