Изменение механизма катализа гидропероксидлиазы сyp74C3

Цитохромы Р450 – обширная группа белков из семейства цитохромов, осуществляющих реакции окисления молекулярным кислородом органических соединений и являющихся важнейшими элементами системы детоксикации ксенобиотиков. В отличие от большинства цитохромов P450, являющихся монооксигеназами, ферментам семейства CYP74, к которым относятся алленоксидсинтазы (АОС), гидропероксидлиазы (ГПЛ), дивинилэфирсинтазы (ДЭС) и эпоксиалкогольсинтазы (ЭАС), для каталитического действия не требуется ни молекулярный кислород, ни окислительно-восстановительный партнер. В связи с этим, кислород-связывающий домен в их последовательности заменен на центральный домен I-спирали (IHCD). Ранее было показано, что некоторые сайты внутри этого домена непосредственно участвуют в катализе CYP74. Вследствие этого, у ферментов, катализирующих разные реакции, последовательности этого домена различаются. Так, для алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз характерными являются следующие последовательности домена IHCD: TCFNSF для АОС и LGFNAF для ГПЛ. С помощью сайт-направленного мутагенеза в последовательности гидропероксидлиазы MtHPL3 (СYP74C3) люцерны (Medicago truncatula) мы изменили последовательность домена IHCD на таковую, характерную для алленоксидсинтаз. Проведенная замена привела к кардинальному изменению в механизме катализа. Фермент дикого типа катализирует образование полуацеталя, спонтанно распадающегося на альдегид и оксокислоту. В реакции, катализируемой полученной мутантной формой, в отличие от этого, образуются по одному изомеру 9,10-эпокси-11-гидрокси и 9,10-эпокси-13-гидрокси-октадеценовых кислот, а также ряд тригидроксикислот. Таким образом, полученная мутантная форма является высокоспецифичной эпоксиалкогольсинтазой.