Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010

Муравенко Ольга Викторовна

Хромосомная организация геномов растений

с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

академик Юрий Викторович Ильин

Институт цитологии и генетики СО РАН

на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу:

119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана " " 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук А.М. Крицын

Однако большинство из перечисленных выше исследований были выполнены на объектах, метафазные хромосомы которых имеют размеры не менее 5 мкм (большинство злаков, лилейные, многие бобовые). Это связано с тем, что изучение рисунка дифференциального окрашивания небольших хромосом (длиной 1-4 мкм) часто представляет значительные трудности вследствие недостаточной разрешающей способности светооптического микроскопа. Кроме того, геномы мелкохромосомных растений, как правило, имеют небольшие размеры (на один-два порядка меньше, чем геномы злаков или лилейных) и содержат сравнительно мало повторяющихся последовательностей ДНК различных классов, а, следовательно, и конститутивного гетерохроматина. Это обуславливает бедность рисунков С-бэндинга мелких хромосом, что еще в большей степени затрудняет их распознавание. В связи с этим, для изучения кариотипов растений, имеющих небольшие хромосомы, возникла необходимость разработки новых подходов, повышающих разрешение методов хромосомного анализа, а также поиск дополнительных хромосомных маркеров. Важность решения этой задачи связана с тем, что кариотипы значительного числа хозяйственно-ценных культур: технических, масличных, овощных и т.п. представлены хромосомами малых размеров. Для большинства таких растений задача соотнесения молекулярной, генетической и цитологической классификаций хромосом остается весьма актуальной. Особое место среди таких растений занимает лен – культура, имеющая для нашей страны не только большое хозяйственное, но и стратегическое значение. Именно поэтому исследование хромосомной организации генома этого ценного растения и его дикорастущих сородичей представляет собой задачу первостепенной важности.

Разработка новых и усовершенствование существующих методов молекулярно-цитогенетического исследования для повышения разрешающей способности анализа геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания. Изучение кариотипов таких растений (низших и высших) с целью идентификации индивидуальных хромосом, выявления структурных перестроек, изучения внутривидового хромосомного полиморфизма, а также сравнения геномов родственных видов для уточнения их таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей.

1. Разработка комплекса методов, повышающих разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга на модельных объектах (человек, ячмень, пшеница) и объектах исследования (ромашка, лен, горох).

2. Поиск дополнительных молекулярных и цитогенетических маркеров для FISH-картирования хромосом и геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга:

• 
  применение универсальных маркеров – генов рибосомных РНК и теломерной последовательности ДНК,
  
• 
  маркеры из тотальной геномной ДНК,
  

• 
  оптимизация методов выявления флуорохромного бэндинга на хромосомах растений после процедуры FISH.
  

4. Исследование с помощью разработанных подходов кариотипов растений с хромосомами малых размеров или с неинформативным рисунком дифференциального окрашивания с целью точной идентификации их хромосом, выявления структурных перестроек, определения родственных взаимоотношений, уточнения таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей изученных видов. Особое внимание предполагается уделить растениям, имеющим хозяйственную ценность (хлопчатник, лен, горох, ромашка) или используемым в качестве модельных объектов.

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, так как основные результаты получены впервые и/или на объектах, не исследовавшихся ранее.

На модельном объекте – ячмене разработана модификация метода, позволяющая выявлять рисунок ранней репликации хромосом у растений. Показано, что у растений, также как и у животных, наблюдается высокая консервативность последовательности репликации районов хромосом в родственных геномах. Подобно млекопитающим, у растений выявляется сходство рисунков ранней репликации и G-подобного окрашивания хромосом после обработки трипсином.

Разработана методика получения препаратов митотических метафазных хромосом низкой степени конденсации с помощью предобработки делящихся клеток интеркалятором ДНК 9-аминоакридином. Установлено, что для достоверного анализа хромосомного полиморфизма по С-блокам длина недоконденсированных хромосом не должна более чем в три раза превышать средний размер этих же хромосом, получаемых без использования интеркалятора. Методика существенно расширяет возможности анализа хромосом человека и растений, особенно мелкохромосомных видов, а также видов с неинформативным рисунком С-окраски хромосом.

Обнаружено, что окрашивание недоконденсированных хромосом растений ацетоорсеином позволяет выявлять высокоразрешающий G/R-подобный рисунок дифференциального окрашивания (OR-бэндинг), содержащий значительно большее число сегментов по сравнению с С-окраской. Установлено, что OR-бэндинг хромосомо- и видоспецифичен и хорошо воспроизводим. С помощью последовательного OR-С/DAPI-окрашивания хромосом льна и гороха впервые продемонстрировано, что ацетоорсеином не окрашиваются прицентромерные, крупные интеркалярные и теломерные гетерохроматические районы хромосом.

Показано, что локализация с помощью FISH на хромосомах генов рибосомных РНК позволяет использовать их в качестве эффективных дополнительных молекулярно-цитогенетических маркеров для идентификации мелких хромосом и хромосомных перестроек в геномах растений.

Продемонстрирована перспективность использования для растений подходов, разработанных с целью исследования генома человека. Показана принципиальная возможность получения NotI-библиотек из небольших геномов мелкохромосомных растений и их использования для изучения этих геномов и поиска молекулярных маркеров хромосом.

У мелкохромосомных растений использование собственной геномной ДНК в качестве зонда для FISH позволяет выявлять на хромосомах рисунки гибридизации, сходные с C-бэндингом.

Установлено, что применение двух новых АТ-специфичных флуоресцентных соединений – димерных бис-бензимидазолов – позволяет выявлять более контрастные рисунки дифференциального окрашивания по сравнению со стандартно используемыми флуорохромами DAPI и Hoechst 33258. Это не только расширяет возможности точной идентификации хромосом и хромосомных перестроек, но и FISH-картирования на них различных зондов.

По рисункам ранней репликации впервые идентифицированы хромосомы в диплоидном A₁ геноме дикорастущего хлопчатника Gossipium herbaceum var. africanum и аллотетраплоидном (AD)_2, геноме тонковолокнистого хлопчатника G. barbadense, а также проведено разделение хромосом (AD)₂ генома на A_b и D_b субгеномы. Обнаружено сходство рисунков ранней репликации хромосом в родственных геномах.

С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей и показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta).

По рисунку С-бэндинга повышенного разрешения (после 9-АМА предобработки) проведена идентификация хромосом в кариотипах ромашки аптечной и двух родственных видов ромашек. Установлено, что Matricaria inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом M. maritima, а M. chamomilla имеет родственный геном.

По рисункам С/DAPI-бэндинга идентифицированы все хромосомы гороха, включая морфологически неразличимые при равномерном окрашивании 1 и 2 пары гомологов. Это позволило провести исследование внутривидового полиморфизма гетерохроматических районов хромосом, а также обнаружить двойную транслокацию с одновременной перицентрической инверсией у линии гороха с перестроенным кариотипом.

Сравнительное исследование геномов двухромосомных злаков из родов Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.

Впервые с помощью комплекса высокоразрешающих модификаций методов С/DAPI-бэндинга и одновременного FISH-картирования на хромосомах генов 26S и 5S рРНК изучены геномы возделываемого вида льна (Linum usitatissimum L.) и 25 дикорастущих видов из 6 секций рода Linum L., произрастающих в Евразии и Африке. Установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. thracicum Degen. и L. czernjajevii Klokov; уточнены хромосомные числа у L. decumbens Desf ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). Впервые в кариотипах видов секции Syllinum обнаружены В-хромосомы и изучена их структура и установлено, что число А-хромосом у этих видов равно 28.

По сходству кариотипов, все изученные виды льнов разделились на 8 групп, что совпало с распределением этих видов на кластеры по данным RAPD-анализа. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа подтвердили обособленность секции Adenolinum от секции Linum, выявили геномное сходство видов секций Adenolinum и Stellerolinum, а также показали обособленное положение видов L. narbonense L. и L. nodiflorum L. от других видов льна. Проведенный анализ позволил уточнить таксономический статус некоторых видов секций Linopsis, Syllinum, Linum и Adenolinum. Проведена реконструкция возможных филогенетических взаимосвязей культурного и дикорастущих видов льна.

Впервые на основании использования цитологических маркеров проведена полная идентификация хромосом у двух видов хлопчатников. Предложенная нами классификация хромосом хлопчатников, остается единственной, и по сей день используется всеми авторами, изучающими геномы возделываемых видов хлопчатников и их дикорастущих сородичей.

Выявлены новые кариологические характеристики видов, входящих в состав родов Galdieria, Cianidium, Gossypium, Matricaria, Zingeria, Calpodium, Linum, позволяющие уточнить их таксономический статус и происхождение.

Полученные результаты могут быть применены для ускорения селекционного процесса, направленного на получение новых высокопродуктивных и устойчивых сортов льна, гороха и ромашки аптечной. Результаты также могут быть использованы в геномных исследованиях льнов секции Syllinum, которые являются продуцентами биологически активных соединений, применяемых в фармакологии в качестве противоопухолевых препаратов.

Применение интеркалятора ДНК 9-АМА и новых флуоресцентных красителей (димерных бис-бензимидазолов) не только расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов ценных сельскохозяйственных культур, но и может существенно повысить точность цитогенетического анализа и картирования хромосом человека, что особенно важно для проведения сложной перинатальной цитогенетической диагностики плода.

Сведения, полученные о геномах видов рода Linum, заложили цитогенетические основы для объединения генетической и цитологической классификаций хромосом и тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.

Результаты исследования могут быть также использованы в курсах лекций и лабораторных работах по цитогенетике в средних и высших учебных заведениях.
Апробация работы.

Результаты, полученные в данной работе, представлены на следующих научных конференциях: VI International Barley Genetic Symposium, 1991; 17 International Congress of Genetics, 1993; II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений", 1993; 26 Annual Meeting of American Society of Cell Biology, 1994; V (1996),VIII (1998) и XI (1999) Конференции "Геном человека"; V International Oat Conference & VII International Barley Symposium, 1997; XI(1997), XII(1999), XV(2005) Всероссийские совещания "Структура и функции клеточного ядра"; XIX(1998), XX(2000), XXIV (2008) International Congress ISAC, II (1997), III (1999), IV (2001) VII(2007) и VIII(2009) Международные симпозиумы "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования"; XIII International Genome Sequencing and Analysis Conference, 2001; Международный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", 2001; International Polyploidy Conference, 2003; III(2004) и V(2009) Съезды ВОГиС; IV International Conference BGRS, 2004; Международная конференция "Молекулярная и прикладная генетика", 2005; Международная научная конференция "Современные проблемы генетики", 2005; V Международное совещание по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, 2005; Human Genome Meeting, 2001 и 2006; 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine, 2006; Международная конференция "Генетика в России и мире", 2006; 16^th International Chromosome Conference (ICC), 2007; Международная конференция "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы", 2007; II Научно-практическая конференция "Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы", 2008; II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию ЦИН РАН, 2007; Симпозиум памяти Г.А. Левитского "Хромосомы и эволюция", С-Петербург 2008; VI(2008), V(2009) Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов"; International Conference "Chromosome, 2009".

Для исследования хромосом растений были разработаны методы выявления рисунков ранней репликации хромосом и искусственной задержки конденсации митотических хромосом, а также модифицированы методики OR-, С-, DAPI-, CMA- и Ag-ЯОР-дифференциального окрашивания хромосом. G-подобное окрашивание хромосом после обработки трипсином проводилось согласно уже известной методике [Friebe et al., 1996]. Геномная ДНК выделялась стандартным СТАБ-методом [Murray, Tompson, 1980]. Клонирование фрагментов 26S и 5S рДНК, выделенных с помощью ПЦР из генома Linum austriacum L., проводилось в клетках Escherichia coli (XL 10-Gold Ultracompetent Cells, Stratagene) с использованием вектора pTZ57R (Fermentas, St.Leon-Rot, Germany) согласно протоколу производителя. Для получения геномных NotI библиотек и их анализа, определения количества ДНК в расчете на 1С, проведения высокоразрешающего RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле, анализа последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК применены методики, разработанные ранее [Бойко и др., 1985; Kashuba et al., 1999; Родионов и др., 2005; Зеленина и др., 2006]. Для поиска гомологий сиквенсов клонированных последовательностей с имеющимися в базах данных использованы NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2. Для гибридизации на хромосомах геномной ДНК, клонированных геномных фрагментов, генов рибосомных РНК и синтезированной меченной флуорохромом олигонуклеотидной теломерной последовательности арабидопсиса (CCCTAAA)₃–С₆-Cy3 (БиоЧип, ИМБ РАН) специально были разработаны различные модификации метода FISH. Исследование проводили с помощью систем цитогенетического анализа (микроскоп, ССD-камера), а также специализированных программ хромосомного анализа ImageJ 1.42 (National Institutes of Health, USA), ВидеоТестКарио 1.5 и 3.0 (ВидеоТест, Сантк-Петербург, РФ).

Знание любого генома неполно без исследования его хромосомной организации. У растений такая работа обычно начинается с изучения числа и морфологии метафазных хромосом в митозе с последующей идентификацией гомологичных пар. Существует несколько возможностей решения задач идентификации и исследования хромосом в кариотипах растений. Как правило, для каждого конкретного кариотипа необходимо подбирать наиболее эффективные методы анализа и последовательность их применения. Кроме того, нужны способы, позволяющие быстро и с наименьшими потерями информации провести регистрацию изображений хромосом и их объективное исследование. Это легко разрешимо в век компьютерных технологий, которые позволяют быстро получить цифровое изображение хромосом, выявить максимальное число хромосомных маркеров и провести анализ хромосом в интерактивном режиме, т.е. создать объектспецифичный алгоритм изучения хромосом.

При исследовании мелких хромосом со сходной морфологией гарантированный результат можно получить только при комплексном применении всех вышеперечисленных подходов. Именно такой эффективный подход к изучению кариотипов растений с небольшими хромосомами представлен ниже. Подход включает комплекс высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов исследования, позволяющих получать достаточное число маркеров для распознавания и сравнительного изучения мелких хромосом или хромосом с малоинформативным рисунком С-бэндинга.
1.1. Рисунок ранней репликации хромосом растений.

Поиск новых методов, позволяющих получать рисунок дифференциального окрашивания высокого разрешения, был начат нами с методики выявления репликативного бэндинга, основанной на асинхронности репликации ДНК хромосом в течение S-фазы. В основе этого метода лежит включение в процессе репликации ДНК аналогов оснований с последующей их детекцией. В результате, на хромосомах млекопитающих выявляется высокоразрешающий так назваемый "репликативный" бэндинг. У млекопитающих процесс синтеза ДНК имеет двухфазный характер, поэтому в хромосомах можно выявлять рисунки, соответственно, ранней и поздней репликации. У человека рисунок ранней репликации сходен с G-, а поздней – с R- и С-бэндингом при использовании так называемого FPG (Fluorochrom Plus Giemsa) метода выявления репликативного бэндинга [Захаров и др., 1982]. Применительно к хромосомам растений мы адаптировали вариант метода выявления рисунков ранней репликации хромосом - BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинг. Он основан на встраивании бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК в начале S-периода ее синтеза и последующим разрушением участков ДНК со встроенным аналогом с помощью облучения ультрафиолетовым светом [Захаров и др., 1982]. При этом участки хромосом, реплицирующиеся в середине и конце S-фазы, выделяются как темно окрашенные (Giemsa-положительные) сегменты (бэнды). В этом варианте методики используется обработка BrdU в высокой концентрации, что блокирует большинство делящихся клеток корневой меристемы в начале S-фазы. После снятия BrdU-блока, в первом митотическом делении на хромосомах выявляется рисунок ранней репликации.

Для отработки методики в качестве модельного объекта было выбрано крупнохромосомное растение – ячмень (Hordeum vulgare L.), хромосомы которого имеют длину 6-12 мкм. У этого модельного объекта нам удалось получить рисунок ранней репликации, который был специфичен для каждой из 7 гомологичных групп хромосом (Рис. 1).




Рис. 1. Кариограмма хромосом H. vulgare. В каждой гомологичной группе (номера 1-7) хромосомы расположены по типам окрашивания слева направо:

– рисунок поздней репликации хромосом (по данным Uozu et al., 1997);

– рисунок ранней репликации хромосом;

– рисунок G-подобной окраски (окрашивание раствором Giemsa после обработки трипсином);

– рисунок С-окраски хромосом.
Ранее считалось, что у растений асинхронность репликация ДНК в течение S-периода выражена в меньшей степени, чем у млекопитающих [Cortes et al., 1980; Kakeda, Yamagata, 1991]. Однако, как показали наши исследования, асинхронность репликации ДНК в течение S-периода у растений может проявляться достаточно отчетливо. При этом на хромосомах ячменя, как и на хромосомах человека [Захаров и др., 1982], рисунок поздней репликации хромосом в целом совпадает с рисунком С-окраски [Uozu et al., 1997], а рисунок ранней репликации хромосом – с рисунком G-подобного дифференциального окрашивания, выявляемого на хромосомах после обработки трипсином (Рис. 1). Этот факт еще раз подтверждает единство основных принципов хромосомной организации геномов высших эукариот.

Большое число сегментов, которые выявил на хромосомах ячменя метод репликативного бэндинга, побудило нас попытаться использовать этот подход для изучения мелких хромосом растений с целью идентификации этих хромосом по рисункам ранней репликации (См. раздел 2.1).

Другой подход, который используют при изучении кариотипов растений с малыми размерами метафазных хромосом – это их анализ в прометафазе или профазе, когда отчетливо виден рисунок дифференциальной конденсации хромосом, который можно применять для их идентификации. Однако, этот метод не получил широкого распространения, поскольку получение большого количества прометафазных и профазных хромосом связано с рядом методических сложностей [Fukui, Mukai, 1988].

Более широкие перспективы имеет подход, основанный на искусственном торможении процесса конденсации хромосом за счет встраивания молекул интеркаляторов между парами оснований молекулы ДНК. К числу ДНК-интеркаляторов, задерживающих конденсацию хромосом, относятся такие широко применяемые флуоресцентные красители, как этидий (ЭБ) или акридиновый оранжевый (АО) [Зеленин, 1967; Zelenin, 1999]. Введение интеркаляторов в делящиеся клетки приводит к увеличению продолжительности профазы и метафазы и накоплению в этой стадии большого числа клеток с недоконденсированными или искусственно "удлиненными" хромосомами. На таких хромосомах разрешающая способность любого дифференциального окрашивания повышается.

С целью замедления конденсации хромосом растений мы использовали предобработку делящихся клеток ДНК-интеркалятором 9-аминоакридином (9-АМА). При выборе этого агента мы исходили из простоты его структуры (отсутствии множественных боковых групп), а также низкой константы связывания 9-АМА с ДНК. Эти особенности 9-АМА гарантируют его легкое удаление из хромосом при фиксации и последующих обработках, а, следовательно, использование 9-АМА не препятствует применению в дальнейшем различных методик дифференциального окрашивания хромосом.

Отработку метода задержки конденсации хромосом с помощью 9-АМА проводили на хромосомах человека, поскольку степень их конденсации легко оценивать по числу G-бэндов на гаплоидный набор, и на хромосомах ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), степень конденсации которых оценивали по числу OR-бэндов. Для сравнения использовали обработку этидием, которую часто применяют для задержки конденсации хромосом человека и животных и получения рисунка дифференциального окрашивания более высокого разрешения. Было исследовано влияние 9-АМА и этидия в различных концентрациях (от 0,1 до 10,0 мкг/мл) на задержку конденсации хромосом. Установлено, что для получения сходных эффектов задержки конденсации хромосом требуется существенно более низкая концентрация 9-АМА, чем этидия.

Добавление в культуру лимфоцитов крови человека 9-АМА до конечной концентрации 0,5-1,0 мкг/мл или этидия - до l,0-5,0 мкг/мл за час перед фиксацией давало возможность получать значительное число метафаз с длинными хромосомами и с небольшим числом хромосомных наложений на препаратах. В этих условиях средняя длина хромосом увеличивалась на 70-90% по сравнению с хромосомами, не обработанными 9-АМА. При одинаковой степени разрешения рисунков G бэндинга их контрастность, после обработки 9-АМА, оказалась заметно выше, чем после обработки этидием. Этот факт позволяет полагать, что использование предобработки 9-АМА весьма перспективно для повышения степени разрешения различных типов дифференциального окрашивания хромосом человека при проведении высокоточного цитогенетического анализа.

Для ромашки аптечной оптимальные условия предобработок интеркаляторами, приводящих к достаточному удлинению хромосом и выявлению четкого OR-бэндинга на всех хромосомах, были определены как 4-10 мкг/мл для этидия и 0,5-2,0 мкг/мл для 9 АМА за 12 часов до фиксации при температуре +26С. Уменьшение концентрации и времени обработки интеркаляторами приводило к снижению эффекта задержки конденсации хромосом. Увеличение концентраций 9-АМА и этидия и/или длительности обработки этими реагентами приводило к значительному увеличению длины хромосом и числа хромосомных наложений, а также к снижению числа метафазных пластинок на препаратах.

Таким образом был разработан протокол получения препаратов с большим числом "удлиненных" метафазных хромосом, основанный на использовании 9-АМА. Установлено, что обработка 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА в течение часа до фиксации клеток приводит к существенному возрастанию разрешающей способности G-окрашивания хромосом человека с 400 до 850 G-бэндов на гаплоидный набор. Для ромашки оптимальные условия обработки составляли 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА и в течение 12-24 часов до фиксации корневых меристем. При таких условиях 9-АМА не подавляет митотическую активность клеток меристемы, а длина хромосом достаточна для получения высокоразрешающего OR-бэндинга (250-260 бэндов на гаплоидный набор).

Обнаружено, что 9-АМА в качестве интеркалирующего агента имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с этидием:

• 
  достижение более сильного деконденсирующего эффекта при более низких концентрациях агента;
  
• 
  легко отмывается фиксатором и поэтому не флуоресцирует на хромосомных препаратах и не мешает последующему применению различных методов флуоресцентного дифференцильного окрашивания и FISH;
  
• 
  на хромосомах выявляется более четкий и контрастный рисунок бэндинга.
  

Методика задержки конденсации митотических хромосом была апробирована для повышения разрешающей способности OR- и С-бэндинга хромосом разных размеров у высших растений (лен, ромашка, горох, цингерия). Кроме того, использование 9-АМА впервые дало возможность визуализировать и исследовать с помощью светового микроскопа хромосомы одного из самых примитивных низших растений – красных одноклеточных водорослей. Установлено, что для всех исследованных объектов оптимальной является одна и та же концентрация 9-АМА – 0,5-1 мкг/мл. Все изложенное позволяет рекомендовать использование этого интеркалятора для получения высокоразрешающего дифференциального окрашивания как хромосом растений, так и человека и животных.

Оказалось, что, несмотря на значительно больший разброс длин хромосомы 4 льна (2,3-7,1 мкм), после обработки 9-АМА по сравнению с необработанными (1,5-2,8 мкм) (Рис. 4), основной рисунок С-окраски мало изменяется. При длине хромосомы от 2,3 до 5,5 мкм обнаружено постоянство размеров и вариабельности крупных гетерохроматических блоков; не меняется также положение на хромосомных плечах небольших интеркалярных С-бэндов. Это позволяет проводить оценку полиморфизма С-блоков в хромосоме 4 льна, подобно тому, как это делается и у ячменя.

Проведенное нами исследование рисунков OR-бэндинга хромосом ромашки, гороха и цингерии позволило определить некоторые общие особенности этого типа окрашивания. Установлено, что рисунок OR-окраски выявляется на недоконденсированных прометафазных хромосомах. Рисунок OR-окрашивания воспроизводим, хромосомо- и видоспецифичен, несмотря на то, что число выявляемых на хромосомах растений OR-бэндов зависит от степени конденсации хромосом, подобно тому как это имеет место при G- или R-окрашивании хромосом животных. [

При окрашивании хромосом растений ацетоорсеином было обнаружено, что, в отличие от окрашивания по С-методу, прицентромерные гетерохроматические районы хромосом обычно окрашиваются очень слабо. Для детального сравнения двух различных методов окрашивания была проведена последовательная обработка хромосом льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.) ацетоорсеином и АТ-специфичным флуоресцентным красителем DAPI. Как известно, на хромосомах растений, в том числе у льнов, DAPI-позитивные районы обычно совпадают с С-бэндами (Рис. 5).





Рис. 5. Хромосомы L. grandiflorum: а – OR-бэндинг, б – последующее окрашивание DAPI, в – компьютерное совмещение DAPI- и OR-бэндинга, г –С-бэндинг.
В результате последовательного OR- и DAPI-окрашивания хромосом льна и последующего компьютерного наложения изображений выявлено, что ацетоорсеин слабо окрашивает не только околоцентромерные, но и теломерные гетерохроматические районы. Кроме того, было обнаружено, что большинство крупных блоков интеркалярного гетерохроматина также не окрашивается ацетоорсеином (Рис. 5 и см. разделы 2.3 – 2.5).

Таким образом, было установлено, что рисунок OR-бэндинга, хотя и зависит от степени компактизации хромосом, не является простым отражением рисунка дифференциальной конденсации. Вероятно, интенсивность окрашивания ацетоорсеином зависит не только от плотности упаковки отдельных районов хромосом, но и от особенностей структурной организации этих районов.

В период активной интеграции молекулярной биологии и цитогенетики значительно упростилась идентификация отдельных хромосом или геномов. Стало возможным проводить молекулярное кариотипирование с помощью метода FISH, позволяющего локализовать на хромосомах молекулярные маркерные зонды – хромосомоспецифичные или геномоспецифичные последовательности ДНК, т.е. осуществлять физическое картирование хромосом. У растений в качестве маркерных зондов обычно используются различные повторяющиеся последовательности.

Известно, что хромосомные слияния, имеющие место при реорганизации кариотипов растений в процессе видообразования, могут приводить к изменению числа и морфологии хромосом в родственных геномах. В некоторых случаях на месте слияния хромосом остаются теломерные повторы, обычно локализованные на концах хромосом. Наличие таких интерстициальных сайтов теломерных повторов может свидетельствовать о произошедших хромосомных перестройках и, в ряде случаев, дает возможность исследовать особенности реорганизации кариотипов в процессе видообразования. Кроме того, локализация таких дополнительных мест расположения теломерных повторов на хромосомах может служить в качестве дополнительных маркеров при распознавании трудно идентифицируемых хромосом (Рис. 6).

Рис. 6. FISH с зондом теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах: а –Pisum sativum (интерстициальные сайты гибридизации отсутствуют);

Наиболее часто в качестве эффективных хромосомных маркеров используют рисунки локализации последовательностей генов 45S и 5S рРНК. Как известно, ДНК-последовательности рибосомных генов высоко консервативны и обладают очень низкой видовой специфичностью. Это позволяет последовательности генов рибосомных РНК, выделенные из генома какого-либо одного вида, применять в качестве зондов для исследования их хромосомной локализации с помощью FISH как у близких, так и у филогенетически далеких видов. В нашей работе была продемонстрирована возможность использования последовательности 18S-28S рДНК, выделенной из генома человека (клон 22F9 из библиотеки LA-13NCO1), для гибридизации с хромосомами ячменя (Рис.7а). Также, показана возможность использования зондов 18S-26S и 5S рДНК (клоны рТа71 и рТа794 соответственно), полученных из генома мягкой пшеницы [Gerlach, Bedbrook, 1979], для гибридизации с хромосомами человека и примитивных фотосинтезирующих эукариот – красных одноклеточных водорослей (Рис. 7в и 7б).

Высокое содержание различных классов повторяющихся последовательностей в геномах растений привело к разработке метода геномной гибридизации in situ (GISH), который открыл тайны происхождения многих аллополиплоидных видов, в частности злаков [Paterson et al., 2000].

Метод продолжает совершенствоваться до сих пор и позволяет различать все более близкородственные геномы. Например, недавно нами был разработан высокочувствительный вариант метода GISH, позволивший нам разделить в метафазных пластинках мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) геномы А, В и D (Рис. 8). Кроме того, с его помощью стало возможным уточнить структуру перестроенных хромосом и определить точки разрывов на хромосомных плечах.


Рис. 8. A-, B-, и D- геномы гексаплоидной пшеницы, дифференцированные с помощью GISH.
Существуют разные варианты метода GISH, использующие геномную ДНК одного или нескольких видов для выявления сайтов локализации консервативных повторяющихся последовательностей на хромосомах как родственных, так и не родственных видов растений [Belyaev, Raskina, 1998; Zoller et al., 2001]. Для хромосом льна (L. usitatissimum) нами разработан вариант метода гибридизации геномной ДНК, выделенной из того же вида. Методика заключается в совместной денатурации на препарате ДНК хромосом и зонда (геномной ДНК) в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, при температуре 73ºС, и последующей ренатурации в течение 15 минут при 40ºС. В этих условиях на хромосомах льна гибридизуется часть высокоповторяющихся последовательностей ДНК, что позволяет выявлять на мелких хромосомах льна рисунок локализации зонда, напоминающий С-бэндинг (Рис. 9).
Рис. 9. GISH с собственной геномной ДНК на хромосомах L. usitatissimum.

Развитие этого подхода открывает широкие перспективы для выявления рисунков распределения высокоповторяющихся последовательностей ДНК на хромосомах небольших размеров, поскольку разрешение этого метода выше других способов дифференциальной окраски. Геномную ДНК легко выделить из любого растения, поэтому возможность ее использования при FISH-картировании в качестве зонда, позволяющего выявлять дополнительные хромосомные маркеры очень ценна, особенно для хромосом с трудновыявляемым и бедным рисунком С-бэндинга.

Картирование уникальных генов и различных анонимных последовательностей ДНК на хромосомах человека было начато задолго до начала тотального секвенирования его генома и во многом послужило основой для его успешного проведения. С целью исследования генома человека были разработаны различные методики получения BAC-, YAC- библиотек геномных ДНК-последовательностей, позволившие секвенировать отдельные фрагменты генома и собирать из них фрагменты генома большего размера. Был разработан метод создания NotI–библиотек, специфичных для одной хромосомы и для генома в целом. Поскольку NotI сайты ассоциированы с генами, то исследование последовательностей ДНК из этих библиотек позволило обнаружить и картировать множество генов на хромосомах человека. Можно привести пример гена Harakiri (Рис. 10), вовлеченного в процесс апоптоза клеток.

Р
ис. 11. Гомология клона 32 из генома L. usitatissimum (сорт Оршанский 2) gypsy-подобному семейству ретротранспозонов (Athila).

При проведении FISH для окраски хромосом обычно используют АТ-специфичный флуоресцентный краситель DAPI, выявляющий Q-подобный рисунок окрашивания на хромосомах животных. У растений после гибридизации in situ метафазные хромосомы обычно окрашиваются DAPI монохромно. Как правило, такое окрашивание характерно для растений с крупными геномами (пшеница, ячмень). У растений с небольшими геномами на метафазных хромосомах могут выявляться рисунки DAPI-дифференциального окрашивания. Как показали наши исследования, этот бэндинг становится виден на хромосомах особенно отчетливо после предобработки 9-АМА. Такая предобработка позволила выявить рисунок DAPI-бэндинга не только у льнов (геном льна посевного около 600 млн.п.н.) и цингерии (геном около 1,5 млрд п.н.), но и у гороха (геном около 4,3 млрд п.н.) (См. разделы 2.4 – 2.6).

Рисунок DAPI-дифференциального окрашивания хромосом растений, подобен рисунку С-бэндинга (Рис. 12-I а, б). При этом, чем длиннее хромосомы, тем выше разрешение DAPI-бэндинга (Рис. 12-II, III).



Рис. 12. Изменение рисунка DAPI-окрашивания хромосом L. grandiflorum в зависимости от степени компактизации хромосом:

I – метафаза (а – DAPI-окрашивание и

б – инвертированное изображение),

II – прометафаза,

III – поздняя профаза.
Особенно важно получение высокоразрешающих рисунков DAPI-бэндинга после FISH, поскольку это позволяет не только точно идентифицировать хромосомы, но и отдельные районы хромосом, что существенно повышает точность картирования различных зондов.

Поскольку рисунок DAPI-бэндинга на хромосомах растений не всегда бывает достаточно контрастным, с целью улучшения качества дифференциального окрашивания хромосом при FISH, была изучена возможность применения новых флуоресцентных красителей. Было протестировано 10 димерных бис-бензимидазолов (содержащих две модифицированных группы красителя Hoechst 33258), синтезированных в ИМБ РАН [Zhuze et al., 2007]. Из них были отобраны четыре соединения: DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18), при окрашивании которыми хромосом модельного объекта – человека, выявлялся бэндинг, сходный с рисунками дифференциального окрашивания флуорохромами DAPI или Hoechst 33258. Контрастность флуорохромного бэндинга, полученного при использовании этих четырех соединений, и его устойчивость к выгоранию была несколько выше, чем в случае DAPI и Hoechst 33258 .

Результаты нашего исследования показали, что одновременное или последовательное использование нескольких методов выявления на хромосомах молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет успешно идентифицировать мелкие хромосомы и более точно локализовать различные ДНК-зонды, а также получать дополнительную информацию о структурной организации митотических хромосом растений.

Наиболее информативным является сочетание различных видов дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ с одним или несколькими зондами, проводящиеся на одних и тех же хромосомных пластинках последовательно или одновременно. Такой подход не только позволяет наиболее глубоко исследовать хромосомную организацию генома изучаемого растения, но и легко решать многие конкретные задачи. В частности, именно таким образом была проведена полная идентификация трудно распознаваемых хромосом у Linum flavum L. (Рис. 14).




Рис. 14. Кариотип L. flafum после совмещения различных методов окрашивания хромосом: DAPI (синий) и CMA (зеленый), а также FISH с зондами теломерного повтора (AAATGGG) (красный). 1-14 – хромосомные группы, В – добавочные или В-хромосомы.
С
ледует отметить, что любое исследование тонкой структуры мелких митотических хромосом с помощью светооптического микроскопа практически невозможно без современных компьютерных технологий. При анализе хромосом небольших размеров и/или малоинформативным рисунком бэндинга особое значение приобретает оптимизация методов получения оцифрованных изображений хромосом и их последующей компьютерной обработки. Новые возможности по улучшению разрешения самых мелких деталей рисунка дифференциального окрашивания хромосом открывают методы деконволюции изображений. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие оптических аберраций и шумов регистрирующей системы) с помощью применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. В конечном итоге существенно повышается разрешающая способность оптической системы (Рис.15).

Рис.15. Локализация теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах льна (L.usitatissimum) методом FISH. Хромосомы окрашены DAPI (синий).

а – метафазная пластинка до деконволюции;

б – та же метафазная пластинка после деконволюции;

в – улучшение качества изображения с помощью деконволюции позволило распознать гомологи и составить кариограмму.
Анализ кариотипов мелкохромосомных растений значительно облегчают специализированные программы хромосомного анализа, работающие в интерактивном режиме. Примером такой программы, созданной фирмой ВидеоТест совместно со специалистами по хромосомному анализу, и в том числе при нашем активном участии, могут служить программы ВидеоТестКарио 1.5 и 2.0 (ВидеоТест, Санкт-Петербург).

Разработка программы ВидеоТестКарио 1.5 была направлена на создание объективного помощника при разностороннем изучении структуры хромосом (Рис. 16). С помощью этой программы анализ изображений хромосом ведется в интерактивном режиме. Взаимодействие исследователя с различными модулями программы позволяет направленно улучшать изображения хромосом, проводить их измерения, определять центромерные индексы, а также положение и размеры бэндов, что особенно ценно при малом числе маркеров хромосом.

Особенно эффективно сочетание комплексного подхода к изучению хромосомной организации геномов растений с различными молекулярными методами их исследования. Примерами плодотворности одновременного использования цитогенетических и молекулярных технологий (RAPD, ITS, определение количества ДНК в расчете на 1С) для изучения геномов растений могут служить сравнительные исследования различных видов красных микроводорослей, двухромосомных злаков и льнов, а также сортов и линий гороха, подробно описанные в следующей главе.