Determinação da variabilidade genética de plantas da espécie Maclura tinctoria (L.) Gaud em uma população situada na Região Norte de Minas Gerais
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| Determinação da variabilidade genética de plantas da espécie Maclura tinctoria (L.) Gaud em uma população situada na Região Norte de Minas Gerais.
IntroduçãoMaclura tinctoria (L.) Gaud, vulgarmente conhecida por Amoreira, Amora-do-mato ou Taíuva, com distribuição significativa pelo cerrado norte-mineiro, é um vegetal caducifólio, que atinge cerca de 10 metros de altura pertencente à família Moraceae. A localização geográfica dessa espécie vegetal se faz em matas secas, sendo os exemplares mais novos recobertos por espinhos nos ramos e galhos ao passo que as espécies adultas não têm essa característica. Seus frutos, que são semidoces, são comestíveis e sua madeira é utilizada eventualmente na carpintaria. Suas flores são brancas, masculinas, em formato de espiga, medindo 3.5 até 6 cm de largura e com inflorescência feminina de cabeça redonda ou oblonga medindo 6 a 12 mm de diâmetro, ambas axilares solitárias. A dispersão se dá através de mamíferos. O exsudado do caule (látex) e o chá da casca apresentam propriedades medicinais muito utilizados como cicatrizante e antiflamatório. As características dos componentes presentes no látex, na casca e nas folhas (extratos) podem estar relacionadas com a variabilidade genética das plantas. O conhecimento da variabilidade genética dessas plantas lactíferas torna-se interessante, pois, essa variabilidade pode ser correlacionada com os teores (concentração) e qualidade do látex/extrato produzido por essas plantas, permitindo a identificação de genótipos de melhor qualidade do extrato/látex e de melhor ação terapêutica. A espécie Maclura tinctoria (L.) Gaud apresenta-se como uma planta de grande potencial para estudos de fitoterápicos, contribuindo para a obtenção de grandes conhecimentos científicos referentes a espécie. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética de plantas da espécie Maclura tinctoria (L.) Gaud em uma população situada na Região Norte de Minas Gerais.
A. Área de trabalhoO material biológico desse projeto foi coletado na região Norte do Estado de Minas Gerais, na Área de Proteção Ambiental do Rio Pandeiros (APA-Pandeiros), localidade próxima ao município de Januária. Foi amostrada uma população natural de Maclura tinctoria (L.) Gaud para a coleta de folhas. B. Material Biológico para estudos genéticosPara o estudo da caracterização da estrutura genética com utilização de marcadores moleculares, o material biológico consistiu de folhas jovens de indivíduos adultos (reprodutivos). Amostras foliares de 10 indivíduos da população foram coletadas e encaminhadas ao Laboratório de Genética da Conservação da Universidade Estadual de Montes Claros – Unimontes, para extração do DNA. C. Extração e Amplificação do DNA Na extração do DNA a partir das folhas jovens, foi utilizada a metodologia descrita por Doyle & Doyle (1990) [6] com modificações pertinentes. Para a técnica molecular de marcadores ISSR utilizada, foram feitas amplificações dos fragmentos via PCR (Polymerase Chain Reaction) de acordo com Bornet e Branchard (2001) [3]. As reações de amplificação foram feitas em um termociclador GeneAmp PCR System 9700, com volume total de 12 μL, contendo 2 μL de DNA diluído 50x, 1,2 μL de Tampão PCR 10x (500 mM de Tris-HCl, 200 mM de KCl, pH 8.0), 0.8 μL de dNTPs (2,5 mM), 0,3 μL de MgCl2 (15 mM), 2 μL de cada primer (2mM) e 0,2 μL deTaq DNA polimerase (5U/μL). Após uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos; as reações foram submetidas a 35 ciclos de amplificação iguais para todos os primers. Cada ciclo consistiu de 94ºC por 1 minuto, 30 segundo a 47 ºC e um minuto a 72 ºC. Ao final do último ciclo, a extensão final, foi por sete minutos, a 72 ºC. Os fragmentos foram separados em gel de poliacrilamida (5%) em eletroforese vertical. A coloração foi realizada utilizando nitrato de prata e revelada com carbonato de sódio. D. Análise Estatística dos Dados Para a análise dos dados uma matriz binária foi gerada para os fragmentos amplificados a partir da genotipagem dos indivíduos quanto à presença (um) e à ausência de banda (zero). Realizou-se análise cautelosa das fotografias dos géis, e, apenas fragmentos nítidos e definidos foram considerados para se determinar a frequência das bandas nas áreas. A partir da matriz de dados binários foi estimado o Conteúdo Informativo de Polimorfismo (PIC), cujo objetivo é indicar o quanto o marcador utilizado (primer) poder ser informativo. Esse parâmetro é calculado pela fórmula PIC = 2pi (1-Pi), onde, Pi é a frequência do alelo nulo, nos diferentes primers. Este valor de PIC significa a probabilidade de encontrar o marcador em dois estados diferentes (ausente e presente) em duas plantas aleatoriamente da população. Foi estimado o número de alelos observados (Na), o número efetivo de alelos (Ne), a heterozigosidade esperada (He) e a porcentagem de locus polimórficos. Resultados e Discussão Baseado em um padrão de amplificação, oito primers foram selecionados de um total de 12 testados. Dentre os primers de ISSR utilizados no presente estudo, aqueles que possuem maior potencial para utilização, em análise de variabilidade genética em Maclura tinctoria, são: UBC-813, UBC-814, UBC-840, UBC-857, UBC-880 e TERRY, pois produziram, pelo menos, cinco ou mais bandas polimórficas. O valor de PIC (Conteúdo informativo de Polimorfismo) é um parâmetro utilizado para indicar a qualidade do marcador. Segundo a classificação de Botstein et al. (1980) [4], marcadores com PIC superior a 0,5 são considerados satisfatórios em conteúdo informativo, com valores entre 0,25 e 0,5 mediamente informativos, e, com valores inferiores a 0,25 possuem pouca informação. Dos primers utilizados nesse estudo, pode-se observar que este parâmetro variou de 0,29 a 0,47, com valor médio de 0,37, o que classifica esses locus como marcadores medianos em conteúdo informativo. O número de alelos observados (Na) foi de 2,1 e, o número de alelos efetivos (Ne)1,58. A porcentagem de locus polimórficos variou foi de 100%. Foram considerados polimórficos os locus nos quais a frequência do alelo mais comum foi menor ou igual a 95% (Nei, 1987) [9]. O alto valor observado indica que os iniciadores utilizados foram mais que satisfatórios para a detecção de polimorfismo para a espécie Maclura tinctoria. Utilizando gel de poliacrilamida e marcadores ISSR, Morales (2010) [8] também encontrou 100% dos locus polimórficos para cultivares de morangueiro. Ferreira (2011) [7] estudando a espécie Annona crassiflora, utilizando gel de agarose, encontrou 93,4% dos locus polimórficos com marcadores ISSR. Almeida et al. (2009) [1] encontraram 95% de locus polimórficos para cultivares de cana-de-açúcar com este mesmo tipo de marcador molecular. As estimativas de diversidade genética de Nei (He) foi de 0,34. Esse resultado está em conformidade com outros trabalhos que utilizaram dados obtidos por marcadores dominantes. Oliveira et al. (2008) [10] utilizando marcadores moleculares RAPD, encontram um valor de (He) médio de 0.32 em populações de Acrocomia aculeta. Batista et al. (2008) [2] encontraram um valor razoável de diversidade genética (0,23) para Tibouchina papyrus com o uso de marcadores ISSR. Cota et al. (2011) [5], pesquisando populações naturais de Annona crassiflora com auxílio de marcadores RAPD, encontraram um valor de (He) médio de 0,30, sendo que esse índice variou de 0,21 a 0,30 entre as populações estudadas. ConclusãoObteve-se razoáveis níveis de polimorfismo e de diversidade genética para a população de Maclura tinctoria estudada, o que evidência o potencial da espécie para a prospecção de componentes biológicos importantes (bioprospecção). AgradecimentosOs autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro (Processo 562885/2010-2), a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pela Bolsa de Incentivo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Tecnológico de M. A. S. Pimenta e pelas Bolsas de Iniciação Científica de A. F. Pinho Souza e J.A.S. Ramos; e a Universidade Estadual de Montes Claros – UNIMONTES pelo apoio logístico. |