Asmada (Vitis vinifera L.) Androgenetik Kallus Oluşumu Üzerinde Bir Araştırma(*)
|
|  Yüklə 104.5 Kb.
|
| Asmada (Vitis vinifera L.) Androgenetik Kallus Oluşumu Üzerinde Bir Araştırma(*)
Y.Sabit AĞAOĞLU1 Şebnem ELLİALTIOĞLU1 Birhan MARASALI1 Dilek KALYON2 Özet Hasandede ve Kalecik karası üzüm çeşitlerinde anter kültüründen kallus elde edilmesi amaçlanmıştır. Anter kültürü için en uygun mikrospor gelişme dönemi olan tek çekirdekli mikrospor aşamasının, morfolojik olarak 0.3-1.0 mm uzunlukta soluk yeşil renkli anterlerde bulunduğu belirlenmiştir. Bu anterlerin, korolla rengi koyu yeşilden hafifçe sarıya dönen ve henüz açılmamış çiçek tomurcuklarında bulunduğu görülmüştür. Çiçek tomurcukları, +4oC’de 72, 96 ve 120 saatlik ön uygulamalara tabi tutulmuş, kültüre alınan anterlerdeki gelişme oranları ve farklılaşmalar belirlenmiştir. Anterlere uygulanan soğuk şokları, çeşitler ve ortama katılan hormon kombinasyonlarına göre, anter gelişme oranları bakımından farklı sonuçlar vermiştir. Ancak kallus oluşumu, besin ortamı bileşiminde yapılan değişiklikler sonucunda soğuk uygulaması yapılmayan Hasandede çeşidi anterlerinden elde edilebilmiştir. Mineral tuz içeriği iki kat artırılmış modifiye NN ortamı, Hasandede çeşidi anterlerinde %8.5 oranında embriyogenik yapılı kallus oluşumu sağlamıştır. Kalecik karası çeşidinden androgenetik kallus elde edilememiştir. Research on androgenetic callus formation in grapevine (Vitis vinifera L.) Abstract The present study was undertaken to examine in vitro callus formation from anthers in Hasandede and Kalecik karası (V.vinifera cvs.). Anthers with pale-green color and 0.3-1.0 mm length were determined to express morphologically the uninucleate microspor stage which is the best development stage for anther culture. These anthers were found in un-opened flowers as corolla color turn dark green to yellowish. Differentation and developmental rate of anther cultures were examined after inflorescens were pre-treated with low temperature of +4oC at 72, 96 and 120 hours. According to cultivar and supplemented grow regulators combination of the media, low temperature treatments gave different results on anther development rate. Callus development was obtained from untreated anther of Hasandede cv. on the modified culture media. Modified NN media containing two-folded mineral salt supplied 8.5% embryogenic callus development from the anthers of Hasandede. On the other hand androgenetic callus could not be obtained in Kalecik karası. _______________________________________ 1. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Ankara 2. T.C.Ziraat Bankası Ankara (*) Bu çalışma, Ankara Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenen 931101104 no’lu projeden hazırlanmıştır. Giriş Çok yıllık ve yüksek heterozigotiye sahip olan asmada ıslah çalışmalarının uzun yıllara gereksinim göstermesi, üstün nitelikli yeni genotiplerin ortaya çıkartılmasını amaçlayan ıslah programlarında süre kısaltıcı doku kültürü gibi tekniklerin kullanılmasını zorunlu kılmaktadır. Anter kültürü, ıslah amaçlı çalışmalarda kısa sürede homozigot saf hatların elde edilmesini sağlayan ve bu sayede özellikle tohumla çoğaltılan bitkilerde büyük avantajlar sağlayan bir tekniktir. Vegetatif olarak çoğaltılabilen asma gibi türlerde ise yeni varyasyonların ortaya çıkartılabilmesi ve bunların kalıcı olarak devam ettirilebilmesi için olduğu kadar; bir özelliğin kalıtımını belirleyebilmek amacıyla da genetik ve sitolojik çalışmalarda büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Haploid bitkilerin elde edildiği anter kültürü yoluyla donör bitkinin genotipinde bulunan resesif mutasyonların açığa çıkartılması da anter kültürü sayesinde mümkün olabilmektedir. Doğada haploid asmaya rastlanmamış olmakla birlikte, bazı poliembriyonik çeşitlerde sitokimerik (miksoploid) fidelerin bulunduğu belirlenmiştir (Mullins ve Rajasekaran 1980). Asmada erkek gamet yoluyla haploid bitki elde etmek için yapılan ilk anter ve polen kültürü çalışması 1971 yılında rapor edilmiştir. Ancak bu çalışmada in vitro koşullarda çok çekirdekli mikrosporlar elde edilebilmişse de kallus ve embriyo oluşumu sağlanamamıştır (Mullins 1971). Bu çalışmanın ardından kültüre alınan Vinifera asmalarında kallus oluşumu elde edilmiştir. Oluşan kallusun haploid kromozom yapısına sahip (n=19) ve dolayısıyla polen kökenli olduğu belirlenmiştir. Ancak kallusun farklılaştırılarak embriyo veya adventif organ oluşumuna yönlendirilemediği bildirilmiştir (Gresshof ve Doy 1974). Vitis thunbergii asma anterlerinin kültüründe oluşan kallustan sürgün benzeri farklılaşmalar oluşmuş (Hirabayashi ve ark. 1976), nihayet kültüre alınan asma anterlerinden embriyo ve bitki eldesi V.vinifera x V.rupestris hibritlerinde Rajasekaran ve Mullins (1979) tarafından gerçekleştirilmiştir. Kültüre alınan anterlerin içerisindeki mikrosporların sahip olduğu gelişme dönemi, polen kallusunun elde edilmesinde en önemli faktörlerden birisidir. Asma anter kültüründe, kültüre alınması gereken anterlerin tetrat veya tek çekirdekli mikrospor dönemine sahip olması gerektiği çeşitli araştırıcılar tarafından belirlenmiştir (Mullins ve Rajasekaran 1980, Mauro ve ark. 1986, Cersosimo 1986, Niimi 1987, Stamp ve Meredith 1988). Çiçek tomurcuklarına veya doğrudan izole edilmiş anterlere kültür öncesi düşük sıcaklık uygulamaları yapılmasının, birçok bitki türünde olduğu gibi asmada da anterlerden kallus oluşumu üzerinde etkili olduğu yönünde araştırma sonuçları bulunmaktadır.Mullins ve Rajasekaran (1980), tek çekirdekli mikrosporlara sahip anterlerin +4oC’de 72 saat tutulduktan sonra kültür ortamına dikim yapılmasının Gloryvine asma genotipinde olumlu etki yaptığını ve kallus gelişimi sağlandığını rapor etmiştir. +4oC’de 4 güne kadar uzayan değişik sürelerde soğuk şoku uygulaması yapıldığında androgenik kallus oluşumunun arttığına ilişkin diğer bazı bilgiler de bulunmaktadır (Niimi 1987, Yae ve ark. 1990, Langenbucher ve Alleweldt 1993). Yerli üzüm çeşitlerimizden Hasandede ve Kalecik karası’nda anter kültürü yoluyla haploid bitki elde etmeye yönelik çalışmalara esas teşkil etmek üzere yapılan bu araştırmada, anter kültürü için uygun gelişme dönemine sahip mikrosporların bulunduğu tomurcukların morfolojik gelişme dönemlerinin belirlenmesi ve farklı sürelerde uygulanan düşük sıcaklık şokunun androgenik kallus oluşumu üzerindeki etkisinin ortaya çıkartılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Denemede bitkisel materyal olarak A.Ü.Ziraat Fakültesi Bahçe Bitikleri Bölümü Araştırma ve Uygulama Bağında bulunan, iki yerli şaraplık ve erdişi çiçek yapısına sahip üzüm (Vitis vinifera L.) çeşitleri olan Kalecik Karası ve Hasandede omcalarına ait çiçek tomurcukları kullanılmıştır. Uygun tomurcuk gelişme döneminin belirlenmesi Tetrat ve tek çekirdekli mikrospor gelişme dönemine sahip anterleri içeren tomurcukların hangi morfolojik gelişme aşamasında bulunduğunu belirleyebilmek amacıyla, çiçek salkımlarının braktelerden ayrıldığı safhadan korollanın atılmaya hazır hale geldiği aşamaya kadar beş farklı büyüklükteki çiçek tomurcuklarından çıkarılan anterler ultra-mikrotom ile 0.5-1.0 m kalınlıkta kesilerek semi-tin (yarı ince) kesitler hazırlanmıştır. Metilen mavisi ile boyanan preparatlar ışık mikroskobunda incelenmiş, mikrofotoğrafları çekilmiştir. Şoğuk şoklarının uygulanması Bir önceki aşamadan elde edilen sonuçlara göre yaklaşık 0.3-1.0 mm uzunluğunda, şeffaf soluk renkteki anterleri içeren, 1.5-2.0 mm büyüklükte ve korollası tamamen kapalı tomurcuklar salkım halinde toplanarak laboratuvara getirilmişlerdir. Tomurcuklar cam beherglaslar içerisine konulduktan sonra üzerleri alüminyum folye ile kapatılmış ve +4oC’deki buzdolabına yerleştirilmişlerdir. Burada 72, 96 ve 120 saat sürelerle bekletilen tomurcuklar ile hiçbir soğuk uygulaması yapılmayan kontrol grubu anterleri besin ortamlarına dikilmiştir. Kültür ortamı ve koşulları Denemelerde temel besin ortamı olarak Nitsch ve Nitsch (1969) ortamı (NN) kullanılmıştır. Asma anter kültüründe başarılı sonuçlar verdiği bildirilen ve Altamura ve ark.(1992)’nın yapmış olduğu bazı değişikliklere uyulmuştur. Buna göre, H3BO3 (48.5 M), CuSO4.5 H2O (0.32 M) ve biotin (0.4 M) içeriklerinde değişiklikler yapılmıştır. Sakkarozun %2, agarın %0.8 oranında kullanıldığı birinci deneme aşamasında iki farklı hormon bileşimine yer verilmiştir ( 5.0 mg/l 2, 4-D + 1.0 mg/l BAP; 5.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l kinetin). Denemenin ikinci aşamasında ise besin ortamı olarak mineral tuz bileşimi iki kat zenginleştirilmiş NN ortamı kullanılmıştır. Mullins(1990)’in önerdiği bu ortam bileşimine 0.1 mg/l 2,4-D ve 0.1 mg/l NAA, %3 oranında sakkaroz, %0.7 oranında agar ilave edilmiştir. Kültürler sekiz hafta boyunca karanlıkta ve 251oC’deki sıcaklığa sahip etüvde inkübe edilerek (Altamura ve ark. 1992), bu koşullarda kallus oluşumunun gerçekleşmesi beklenmiştir. Ilk dört haftanın sonunda anter gelişim oranlarının belirlenmesi amacıyla şişerek gelişen ve canlı görünümlü anterler kaydedilmiş, tamamen kuruyarak siyahlaşan anterler ölü anter olarak değerlendirilmiştir. % gelişme oranlarının belirlenmesinde enfeksiyona uğrayan petrilerdeki anter sayıları düşürüldükten sonra bulaşma olmayan anter sayıları esas alınmıştır. Dört haftanın sonunda canlı olarak nitelendirilen anterler taze besin ortamlarına transfer edilmiştir. Bulgular Hasandede ve Kalecik karası üzüm çeşitlerinde beş değişik büyüklükteki tomurcuklardan ve dolayısıyla bunların içindeki anterlerden alınan yatay kesitlerde mikrospor gelişme dönemleri saptanmıştır. Anter kültürü için en uygun olduğu bildirilen mikrospor gelişme aşaması olan “ tek çekirdekli mikrospor” aşamasının, morfolojik olarak 0.3-1.0 mm uzunlukta, şeffaf görünümlü soluk yeşil renkli anterlerde bulunduğu belirlenmiştir. Bu anterlerin korolla rengi koyu yeşilden hafifçe sarıya dönen ve henüz açılmamış çiçek tomurcuklarında bulunduğu görülmüştür. Farklı sürelerde +4oC’de soğuk şoku uygulanan Hasandede ve Kalecik karası anterlerinde iki farklı hormon bileşimine sahip ortam üzerinde elde edilen anter gelişme oranları ve farklılaşan doku sayısı Çizelge 1’de verilmiştir.
Anterlere uygulanan soğuk şoklarının süreleri, çeşitler bazında farklı gelişme oranlarına neden olmuştur. Örneğin 72 saatlik soğuk uygulaması, her iki hormon kombinasyonunda da Hasandede çeşidinde anterlerde gelişme sağlayamazken, Kalecik karası çeşidinde 2,4-D/BAP kombinasyonunda %7.1’lik anter gelişme oranına neden olmuştur. 96 saatlik soğuk uygulaması ise anter gelişme oranları bakımından Hasandede çeşidinde Kalecik karası’na göre daha olumlu etki yapmıştır. 120 saat uygulamasında Hasandede çeşidi anterleri NAA/kinetin kombinasyonunda % 6.8 değerine sahip olmuş, diğer hormon kombinasyonunda ise çok düşük bir performans göstermiştir (%0.8). Kalecik karası çeşidi ise 120 saat soğuk şoku uygulamasından sonra %4.6 ve 2.4’lük anter gelişme oranları vermiştir. Kontrol da dahil olmak üzere gelişen anterler üzerinde sağlıklı ve gelişmesine devam edebilen kallus oluşumu elde edilememiştir. Tabloda yer alan kallus sayıları, anter üzerinde oluşan sert dokulu birer hücre gelişmesini ifade etmektedir. Bu oluşumlar, sağlıklı birer kallustan çok büyüyen organ parçaları şeklinde kalmıştır. Bu nedenle soğuk şoklarını içeren uygulamalar arasında sayısal anlamda anter gelişme oranları bakımından farklılıklar belirlenmiş olmakla birlikte her iki çeşitte de birbirine yakın anter gelişme oranının elde edildiği kontrol uygulaması, bundan sonraki deneme aşamasında kullanılmak üzere seçilmiştir. Çizelge 1. Hasan dede ve Kalecik karası anterlerinde farklı sürelerde uygulanan soğuk şokunun anter gelişme oranları üzerine etkisi
Denemenin ikinci aşamasında, Nitsch ve Nitsch (1969) temel besin ortamındaki mineral tuz içeriği iki kat zenginleştirilen ve 0.1 mg/l düzeyinde 2,4-D/NAA ilave edilen ortamlara anter dikimi yapılmıştır. Soğuk uygulaması yapılmaksızın kültüre alınan 378 adet Hasandede çeşidine ait anterden 63’ünde anılan besin ortamında kallus oluşumu elde edilmiştir. Kalluslardan 32 adedi krem-beyaz renkli ve yumuşak bir yapıda olup embriyogenik yapılı kallus görünümünde olmuştur. Kalan 37 adet kallus ise dağınık yapılı, beyaz renkli ve köpük görünümlü olmuş, doku veya embriyo farklılaşmasına uygun nitelikli bulunmamıştır. Hasandede çeşidinde % 8.5 oranında muhtemelen mikrospor kökenli kallus oluşumu elde edildiği halde, Kalecik karası çeşidinde anterlerde kallus oluşumu meydana gelmemiştir. Hasandede çeşidi anterlerinden oluşan kalluslar alt kültüre alınmış ve bir miktar daha geliştirilmiş, ancak daha sonra hormonsuz ortama transfer edilen kalluslarda bir farklılaşma ve embriyo oluşumu elde edilememiştir. Tartışma Araştırmada uygun besin ortamı kullanıldığında çeşitler arasında farklı tepkiler bulunmakla birlikte asma anterlerinden kallus elde edilebileceği sonucuna ulaşılmıştır. Asma anter kültüründe doğrudan embriyo oluşumu yerine önce polen kallusu oluşumu ve daha sonra bu kallus dokusundan sürgün veya embriyo farklılaşması önceki çalışmalarda rapor edilmektedir (Rajasekaran ve Mullins 1979, Srinavason ve Mullins 1980, Zou ve Li 1981, Gray ve Mortensen 1987, Faure 1990). Tomurcuklara uygulanan soğuk şokları, anter gelişme oranları bakımından çeşitler arasında ve besin ortamında kullanılan hormon kombinasyonları arasında farklılıklar ortaya çıkmasına neden olmuştur. Ancak bu farklılıkları birbiriyle ilişkilendirmek oldukça güçtür. Kullanılan anter sayılarının eşit olmaması nedeniyle istatistiksel bir değerlendirme yapılamadığı halde, Çizelge 1 incelendiğinde “çeşit x hormon kombinasyonu x soğuk şoku süresi” arasında bir etkileşim olduğu görülmektedir. Ancak kontrol uygulamasında çeşitlerin birbirine yakın değerler vermeleri de göz önünde bulundurulduğunda, uygulama parametreleri arasındaki bu etkileşimden yola çıkılarak bir sonuca varmanın sağlıklı olmayacağı yönünde bir görüş oluşmuştur. Denemenin ikinci aşamasında uygun besin ortamı bileşimi seçilmesi halinde soğuk uygulaması yapılmadan da kallus elde edilebileceği dikkate alınarak, ilk aşamadaki kallus oluşmama nedeninin; denemede yer alan çeşitler için uygun besin ortamı bileşiminin kullanılmaması olduğu kanısına varılmıştır. Asma genotipleri, anter kültüründe kallus oluşturma bakımından farklı yanıtlar vermiştir. Hasandede çeşidinde androgenik kallus elde edilebilirken, Kalecik karası çeşidi aynı besin ortamında kallus oluşturmamıştır.Vitis türleri arasında kallus oluşturma ve somatik embriyogenezis özellikleri bakımından doku kültüründe karşılaşılan farklı tepkiler, bu konuda çalışan araştırıcıların çoğu tarafından belirtilmektedir (Hirabayashi ve ark. 1976, Chen 1986, Cersosimo 1986, Stamp ve Meredith 1988, Netzer ve ark.1991). Çalışmamızda kallusların ploidi seviyesi belirlenmemiş olmakla birlikte, kallus dokusunun anterin içinden çıkması, bu dokunun haploid olma olasılığını güçlendirmektedir. Kaldı ki kallusun diploid olması halinde bile, anterlerden oluşan kallustan somatik embriyogenezis yoluyla elde edilen diploid bireyler arasında ortaya çıkan somaklonal varyasyonun da gözardı edilemeyecek kadar önemli olduğu ve bu yolla elde edilmiş mutantlar bulunduğu bildirilmiştir (Roustan ve Fallot 1993). Yerli çeşitlerimizden Hasandede anterlerinde kallus oluşumu için uygun besin ortamı bileşimi belirlenmiştir. Soğuk şoklarının etkilerini daha net bir biçimde ortaya koyabilmek ve kallustan organ ya da embriyo farklılaşmasını sağlayabilmek için, elde edilen bu ilk bulguları değerlendirerek yeni denemeler yapılmasında yarar görülmektedir. Kaynaklar Altamura, M.M., Cersosimo, A., Majoli, C., and Crespan, M., 1992. Histological study of embryogenesis from anthers of Vitis rupestris du Lot cultured in vitro. Protoplasma 171: 134-141. Cersosimo, A., 1986. In vitro anther culture in Vitis sp. (Part 1). Rivistal di Viticoltura e di Enologia 39 (12): 520-531. Chen, Z., 1986. Induction of androgenesis in woody plants. Haploids of higher plants in vitro. pp:42-46., Springer Verlag, Berlin. Faure, O., 1990. Embryons somatique de Vitis rupestris et embryons zygotiques de Vitis sp. morphologie, histologie, histochemie et developpement. Can.J. of Bot. 68: 2305-2315. Gray, D.J., and Mortensen,J.A., 1987. Initiation and maintenance of long term somatic embryogenesis from anthers and ovaries of Vitis longii “Microsperma”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 9(1): 73-80. Gresshof, P.M., and Doy, C.H., 1974. Erivation of a haploid cell line from Vitis vinifera and the importance of stage of meiotic development of anthers for haploid culture of this and anther genera. Z.Pflanzenphysiol. 73: 132-141. Hirabayashi, T., Kozaki, I.,and Akihama,T.,1976. In vitro differentiation of shoots from anther callus in Vitis. HortSci. 11(5): 511-512. Langenbucher,H., and Alleweldt,G., 1993. The effect of different pretreatments on induction of somatic embryogenesis in anthers of grapevine cv. Riesling. Vitis 3(1): 1-7. Mauro, Mc., Nef, C., and Fallot, J., 1986. Stimulation of somatic embryogenesis and plant regeneration from anther culture of Vitis vinifera cv. Cabernet savignon. Plant Cell Reports 5(5): 377-380. Mullins, M.G., 1971. Reports CSIRO Division of Horticultural Research for 1969-1971. Adelaide South Australia, p. 26-27. Mullins, M.G., 1990. Applications of tissue culture to the genetic improvement of grapevines. Proc. of the 5th Int. Symp. on Grape Breeding. Vitis special. Mullins, M.G., and Rajasekaran, K., 1979. Plantlets from cultured anthers of Vitis species and hybrids. Dept. of Agronomy and Horticultural Science, Univ. of Sydney N.S.W. 2006, Australia. Netzer, M.H., Guellec, V., and Brancherd,M., 1991. A study of the performance during somatic embryogenesis of various grapevine rootstocks grown in vitro conditions giving chlorosis. Agronomie 11(2): 125-131. Niimi, Y., 1987. Effect of light and chilling on callus formation from cultured anthers of grape. Bull. of Hiroshima Agri. College 8(2): 337-340. Nitsch, J.P., and Nitsch, C., 1969. Haploid plants from pollen grains. Science 163: 85-87. Rajasekaran, K., and Mullins, M.G., 1983. Influence of genotype and sex-expression of formation of plantlets by cultured anthers of grapevine. Agronomie 3: 233-238. Roustan, J.P., and Fallot, J.,1993. Early in vitro evalution of antocyanin content in brage berries application to the selection of Vitis vinifera cv. Duras somaclones. J. Int. des Sci. de la Vigne et du Vin. 27: 225-229. Srinavason, C. and Mullins, M.G., 1980. High frequency somatic embryo production from unfertilized ovules of grapes. Sci. Hort. 13: 245-252. Stamp, J.A., and Meredith, C.P.,1988. Somatic embryogenesis from leaves and anthers of grapevine. Sci. Hort. 35: 235-250. Yae, B.W., Monn, J.V., Cho, H.M., Lee, D.K., and Hwong, J.H., 1990. Factors affecting callus induction from anthers of Vitis in vitro. Research Reports of the Rural Development Administration Horticulture 32 (1): 15-21. Zou, C.J., and Li, P.F., 1981. Induction of pollen plants of grape (Vitis vinifera). Acta Bot. Sinica 23: 79-81. |