1. Introduzione

La sintomatologia clinica è secondaria alla capacità del virus di infettare prevalentemente le cellule del sistema immunitario e nello specifico i linfociti CD4, producendone non solo l’incapacità di queste di rispondere adeguatamente agli stimoli esterni e quindi di proteggere l’organismo, ma provocando anche una loro massiccia deplezione.

Ciò si concretizza in una grave compromissione della risposta immunitaria cellulo-mediata e nell’avanzare di infezioni opportunistiche e la comparsa di tumori maligni.

Per fare tutto ciò il virus deve penetrare nei linfociti, integrare il proprio genoma e infine produrre altri virioni che, usciti dalla cellula per gemmazione, potranno a loro volta infettare.

La ricerca farmaceutica negli ultimi anni ha fatto passi da gigante producendo farmaci che riescono ad agire in ognuno di questi stadi, come gli inibitori della trascrittasi inversa, delle proteasi e delle integrasi. Ultimamente, conoscendo meglio altri bersagli molecolari da colpire, primo fra tutti le proteine che mediano la fusione dell’evelope del virus con la membrana cellulare, tale ricerca si è spostata verso farmaci che inibiscono la penetrazione del virione, che costituisce il primo stadio mediante il quale il virus attacca i linfociti.

Uno di questi farmaci è già in commercio con il nome di Fuzeon, il cui principio attivo è l’Enfuvirtide, e altri sono in corso di sperimentazione.

Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV, acronimo dall'inglese Human Immunodeficiency Virus), attualmente viene considerato il responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita AIDS, che è caratterizzata dal progressivo indebolimento di tutte le difese dell’organismo, quelle cioè che si mobilitano quando il corpo viene aggredito da microrganismi esterni, come batteri e virus.

È un Retrovirus del genere Lentivirus ed in base alle conoscenze attuali (figura 1), è suddiviso in due ceppi i quali differiscono dal punto di vista genetico (con una analogia di sequenze nucleotidiche di circa il 40%) patogeno ed epidemiologico e li distinguiamo in HIV-1 ed HIV-2. Il primo è prevalentemente localizzato in Europa, America ed Africa centrale, mentre HIV-2 si trova per lo più in Africa occidentale ed Asia e determina una sindrome clinicamente più moderata rispetto al ceppo precedente [1].

Figura 1. Visione di una sezione del virus dell’immunodeficenza acquisita.

Morfologicamente il virione di HIV ha un diametro di circa 100 nm e presenta un capside di forma icosaedrica ed un envelope che ospita le proteine di membrana virali gp120 e gp41.

Il materiale genetico del virione è costituito da due copie di RNA a polarità positiva, le quali sono legate a due proteine basiche del peso, rispettivamente, di 7 e 9 Kd (denominate p7 e p9).

Tale complesso, insieme alla trascrittasi inversa (una DNA polimerasi RNA-dipendente), alla proteasi ed all'integrasi è contenuto in una sezione centrale della particella virale denominata core.

Esso presenta una struttura cilindro/conica ed è costituito completamente da una sola proteina (p24). Tra il core e l'involucro lipoproteico si trova uno strato di materiale elettrondenso costituito completamente dalla proteina virale p17 miristilata che media la gemmazione dalla cellula infetta dopo la replicazione e la formazione di nuovi virioni [2].

2.2 Genoma

I geni che costituiscono il genoma del virus vengono suddivisi in base alla proteine che vengono da loro sintetizzate in: geni che codificano per proteine strutturali che rappresentano i geni fondamentali, e geni che codificano per proteine ad azione regolatrice.

I tre geni fondamentali tre la replicazione virale sono Gag, Pol ed Env.

Il gene Gag codifica per le proteine del core del virione: p24, p17, p9, p7.

Dal gene Pol derivano la trascrittasi inversa, la proteasi e l'ntegrasi mentre Env codifica per le proteine dell’involucro esterno.

Sia Gag che Pol sono trascritti in un mRNA il quale viene tradotto in una proteina di 180 Kd (p180) poi scissa tramite proteolisi. La sua scissione determina la formazione della proteasi, della trascrittasi inversa, della integrasi e di una una proteina di 55 Kd (p55) dalla quale, sempre per proteolisi, derivano la p17, la p24 e la p15. La p15 è il progenitore della p9 e della p7, anch’esse ottenute tramite l'intervento della proteasi.

Env viene tradotto in una proteina di 88 Kd che viene successivamente glicosilata ed a seguito di ciò il suo peso molecolare aumenta fino a 160 Kd (p160). Essa viene scissa a formare le due glicoproteine legate alla membrana esterna: la gp120 e la gp41. La gp41 è una proteina transmembrana con l'estremo NH2 localizzato all'interno del virione mentre la parte COOH è esterna e serve come punto di legame per la gp120 [3].

Oltre a questi geni, HIV contiene altri sette geni accessori che hanno funzioni regolatorie del ciclo virale e della sintesi proteica: Tat, Rev, Nef, Vpr, Tev, Vif, Vpu (quest’ultimo nel genoma di HIV-2 non esiste e ve n'è un altro chiamato Vpx).

Il gene Tat codifica per una proteina con funzione di transattivatore che, in collaborazione con un fattore cellulare, è in grado di intensificare l'espressione dei geni virali. Si ritiene che con la sua azione sia in grado di aumentare la trascrizione dei geni virali di circa 1000 volte.

Rev è essenziale per la trascrizione dei geni Gag, Pol ed Env. Sembra, infatti, che esso sia in grado di agire su Env a livello post-trascrizionale legandosi ad una metà del gene sbloccando la traduzione precedentemente inibita da fattori cellulari legati. Probabilmente l'azione a livello di Pol e Gag è simile.

Il gene Nef codifica per una proteina di 27 Kd capace di legare ed idrolizzare il GTP, quindi possiede un’ attività GTP-asica.

Vpr codifica per una proteina di 15 Kd (p15) che si ritrova associata al virione ed è coinvolta nella riattivazione del virus in corso di infezione latente.

Vif è importante per l'infettività del virione ed inoltre interagisce con una citidina deaminasi cellulare, prevenendone la sua inclusione all'interno del virione neo formato ed evitando così l’azione dannosa sul materiale genetico.

Infine le proteine codificate dal gene Vpu intervengono nella maturazione e liberazione del virus [2].

L’HIV infetta linfociti CD4, macrofagi e cellule dendritiche.

Le alterazioni immunologiche prodotte dall’HIV che sfociano in una sindrome di immunodeficienza acquisita sono la conseguenza dell’incapacità dei linfociti CD4, che rappresentano delle cellule chiave per l’attivazione delle corrette risposte immuni, di mediare correttamente le risposte di difesa dell’organismo e della loro conseguente morte programmata.

Nelle fasi precoci dell’infezione si assiste all’adesione del virus alla membrana cellulare e alla fusione con essa [4] (figura 2, 3).

Il virus entra nelle cellule tramite l’interazione delle sue glicoproteine dell’involucro gp120 e gp41, le quali vengono codificate dal gene Env, e i recettori posti sulla membrana cellulare dei linfociti CD4, tramite il legame ai corecettori CCR5 e CXCR4 delle chemochine (figura 4, 5).

Figura 2.L’HIV interagisce con i recettori della superficie dei linfociti CD4 che derivano dalla stretta associazione con molecole di superficie come i recettori per le chemochine CCX4 e CCR5.

Figura 3. Interazione della gp120 con il sito di legame al CD4 sulla superficie cellulare.

Figura 4. I cambiamenti conformazionali dell’envelope virale e del recettore CD4, permettono il legame della gp120 ad altri recettori sulla superficie cellulare come il CCR5


Figura 5. Interazione tra gp41 dell’envelope virale e un dominio sulla superficie cellulare: l’HIV si fonde con la cellula.

Dopo essere entrato nel citoplasma ed essersi liberato dell’involucro, l’RNA virale funge da stampo per la trascrizione delle catene di DNA complementare (figura 6).

Questa trascrizione è una caratteristica distinta di tutti i Retrovirus ed è una tappa catalizzata da una trascrittasi inversa DNA polimerasi RNAdipendente.

In questo stadio di maturazione del virus esistono due classi di farmaci in grado di bloccare tale fenomeno inibendo la trascrittasi inversa.

Questi farmaci si distinguono in inibitori nucleosidici e inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa [5].

In seguito alla retrotrascrizione del genoma virale il DNA a doppia elica si circolarizza ed entra nel nucleo. L’integrazione del DNA provirale nel cromosoma ospite è mediato da un secondo enzima essenziale che prende il nome di integrasi. Anche se l’integrasi sembra un bersaglio molecolare attraente per il trattamento farmacologico, la scoperta di inibitori da utilizzare in clinica sembra presentare notevoli ostacoli a causa della complessa interazione tra molecole ospiti e le molecole virali durante l’integrazione.

In seguito all’integrazione, il DNA provirale può essere trascritto in RNA dal sistema della trascrizione cellulare.

Questo RNA può poi essere tradotto nelle poliproteine virali o, alternativamente, può essere incorporato in virioni immaturi durante l’assemblaggio. Successivamente i virioni nascenti subiscono un processo di maturazione e di gemmazione dalla membrana cellulare.

Durante la maturazione, le poliproteine codificate dai geni gag-pol vengono scisse dalla proteasi.

Tale enzima può essere bloccato da alcuni farmaci anti-HIV, che determinano lo sviluppo di virioni immaturi che mancano del nucleocapside tipico e che sono incapaci di infettare le cellule. In seguito all’esocitosi, i virioni maturi possono infettare altre cellule e continuare il ciclo [5].

Una volta che il genoma virale si è integrato in quello dell'ospite, può rimanere inattivo dal punto di vista trascrizionale per un periodo di tempo compreso tra mesi od anni. L'input che dà l'avvio alla trascrizione del genoma virale si suppone sia costituito dall'insieme di stimoli che possono attivare la cellula infetta: antigeni, citochine o anche infezioni da parte di altri virus. Ciò avviene in quanto la trascrizione dei geni di HIV è strettamente dipendente da quella dei linfociti infetti. Ciò è stato confermato da vari esperimenti nei quali si è visto che la stimolazione di linfociti o macrofagi infetti con diversi tipi di citochine è in grado di favorire la trascrizione dei geni virali nonché quelli della cellula ospite.

Ciò probabilmente avviene attraverso la mediazione di fattori di trascrizione dei quali uno dei più coinvolti sembra essere NF-kβ [6].

L'espressione dei geni virali viene divisa in due fasi: precoce e tardiva.

Nella prima vengono espressi i geni regolatori, mentre nella seconda quelli strutturali. I geni regolatori, di cui i più noti sono Tat, Nef e Rev e la cui sintesi avviene nel citoplasma grazie ad eventi di splicing molteplici, consentono l'amplificazione della trascrizione genica ad opera della RNA polimerasi cellulare di tipo II e la stabilizzazione degli RNA messaggeri creati successivamente.

Nella fase tardiva avviene la sintesi dei geni strutturali i cui trascritti vengono portati nel citoplasma e lì sottoposti ad un solo splicing ed infine tradotti in proteine. E’ a questo livello che interviene la proteina Rev che, come espresso precedentemente, si lega ai trascritti e ne facilita il trasporto nel citoplasma (figura 7).

Il virus dell’ HIV è in grado di infettare produttivamente i seguenti tipi cellulari: linfociti, macrofagi, cellule della microglia e cellule dendritiche. Da alcuni esperimenti si è avanzata l'ipotesi che esso possa infettare anche i timociti ed i precursori midollari forse appartenenti alla linea mieloide-monocitica. Anche gli astrociti subiscono l'infezione da parte di HIV sebbene essa non sia produttiva.

Sebbene il virus HIV sia in grado di infettare le cellule che presentano sulla loro membrana il recettore CD4, ai fini dell'ingresso nella cellula il recettore CD4 da solo è insufficiente ed il virus si deve legare ad un altro corecettore rappresentato da molecole appartenenti alla famiglia dei recettori con sette domini transmembrana accoppiati a proteine G (seven transmembrane domain G-protein-coupled receptor) e precisamente utilizza CXCR4 (usati dai ceppi con tropismo per i linfociti T) e CCR5 (tipici del ceppo avente tropismo per i macrofagi) [7].

L’ingresso nelle cellule del virus dell’HIV richiede l’interazione sequenziale della glicoproteina virale dell’envelope esterno, gp 120, con il recettore dei linfociti CD4 e un corecettore per le chemochine posto sulla superficie cellulare.

Il legame di gp120 ai suoi corecettori sembra che avvenga cronologicamente dopo quello al CD4.

La glicoproteina virale gp120 media il legame ai recettori dei linfociti formando un complesso la cui costante di dissociazione si aggira intorno a 4x10^-9.

Le glicoproteine poste sull’involucro sono strutture organizzate in oligomeri trimerici, contenenti tre molecole di gp 120 esterne dell’envelope ognuna delle quali è ancorata alla membrana virale attraverso interazioni non covalenti con le tre molecole di gp41 transmembrana.

Le sequenze di gp 120 dei diversi ceppi di virus dell’HIV identificano 5 regioni varibili (V1-V5). La prima delle quattro regioni variabili forma dei tratti esposti sulla superficie che contengono legami disolfuro alla loro basi. Il legame con il linfocita CD4 coinvolge tre regioni non contigue ed altamente conservate di gp120 separate da altre zone, invece, estremamente variabili (figura 8).

Le regioni costanti della gp 120 formano strutture discontinue importanti per l’interazione con i domini di gp41 e con i recettori posti sulla cellula target.

Sia le regioni costanti che quelle variabili di gp 120 sono estesamente glicosilate [8].

La variabilità della glicosilazione della superficie di gp 120 probabilmente modula la capacità del virus di essere immunogenico e antigenico.

La gp 120 lega maggiormente porzioni amino-terminali e domini Ig-simili di CD4. Sono stati identificati attraverso meccanismi di mutagenesi i residui costanti di gp 120 importanti per il legame a CD4.

Il legame della gp120 al recettore CD4 induce cambiamenti conformazionali tramite la seconda regione della glicoproteina che risulta complementare al recettore del CD4 nella cellula linfocitaria. Alcuni di questi finiscono con l’esposizione e/o la formazione di un sito di legame per recettori di specifiche chemochine. Questi recettori per chemochine, soprattutto CCR5 e CXCR4 per HIV-1, fungono da secondi recettori obbligati per l’ingresso virale[9, 10]. La terza regione variabile di gp 120 è il principale determinante di specificità per i recettori delle chemochine [11].

A causa dell’importante ruolo della gp 120 nel legame al recettore e nelle interazioni con gli anticorpi, l’informazione sulla struttura di gp 120 è importante per comprendere l’infezione da HIV.

In figura 9 è riportata la struttura cristallina con 2.5Ǻ di risoluzione del core di gp 120 di HIV parzialmente deglicosilata legata a due domini: al frammento del recettore cellulare CD4 e al Fab (antigen-binding fragment) di un anticorpo, 17 b[12].A causa dell’estesa glicosilazione e della eterogeneità conformazionale associata alla gp 120 dell’HIV, è stata progettata una strategia di cristallizzazione diretta alla modificazione delle proteine di superficie tagliate nelle regioni terminali ed in quelle variabili nelle diverse combinazioni con gp120, estesamente de-glicosilate, e prodotto complessi con vari ligandi [13].

Dopo lo studio abbiamo ottenuto almeno 20 conformazioni di gp120 mutate con i ligandi come complessi ternari costituiti da una forma tronca di gp 120, 2 domini N terminali del CD4 e una porzione di fab estratto da un anticorpo monoclinale umano, il 17b[14, 15] (figura 10).

Figura 9. Glicoproteina gp120 del virus dell’HIV. PDB 1GC1 2,5 A di risoluzione. Struttura della glicoproteina di superficie gp120 di un virus dell’HIV complessato al recettore CD4 e l’anticorpo 17b.



Figura 10. Disposizioni spaziali della gp120 complessata con il frammento del CD4 e l’anticorpo ottenuti tramite riarrangiamenti spaziali

La gp 120 cristallizzata riportata nella figura 11 ha subito la delezione dei residui 52 e 19 rispettivamente nelle estremità N-terminale e C-terminale e la sostituzione del tripeptide gly-ala-gly nei residui 67 v1/v2 e 32 v3. Inoltre sono stati rimossi quasi tutti i gruppi di zucchero esistenti Questa deglicosilazione priva la gp120 di circa il 90% dei carboidrati, ma trattiene più dell’80% delle porzioni non variabili. La capacità di interagire con CD4 e gli anticorpi è uguale o simile a quella della gp120 non modificata [14].

In seguito ai cambiamenti conformazionali che avvengono a livello del legame di gp120 al recettore CD4 e ai corecettori CCR5 o CXCR4, si assiste ad una ulteriore modificazione strutturale che coinvolge la glicopoteina gp 41, con il conseguente risultato dell’esposizione sulla membrana virale di una sequenza altamente idrofobica di amminoacidi che terminano il dominio o il peptide di fusione [16, 17]. La successiva inserzione del peptide di fusione nella membrana cellulare rende capace la gp41 di unire simultaneamente il virus e le membrane cellulari. Il processo di fusione porta all’unione dei lipidi virali e di membrana e alla formazione di un poro di fusione attraverso cui il core virale è trasferito nella cellula ospite. Infine si assiste alla dissociazione di gp120 dal gp41 ancorata alla membrana e al riarrangiamento di gp 41 nella conformazione attiva di prefusione [18]. Durante lo stadio chiamato di prefusione, una regione della molecola gp41 definita N36 è in una conformazione ad α-elica e dopo il legame al recettore, un’altra regione di gp41, precisamente C34, si comprime in un solco idrofobico. È stato dimostrato che per il processo di fusione è importante il contributo di gp41, in particolare della sua parte N-terminale e che questo processo avviene in seguito a cambiamenti conformazionali scatenati dal legame con CD4 e, probabilmente, anche grazie all'attacco dell'ansa V3 di gp120 da parte di alcune proteasi cellulari. Queste modifiche permettono l'inserimento della sequenza N-terminale di gp41, formata da aminoacidi apolari, all'interno della membrana cellulare.

Sebbene la struttura di gp 41 originaria con conformazione precedente alla fusione sia disponibile, sono state determinate importanti strutture ad alta risoluzione per l’estrema stabilità del dominio attivo di fusione di questa proteina e per i virus simili a quelli dell’HIV. Queste strutture rivelano un agglomerato di 6 alfa eliche un core consistente di 3 eliche N-terminali immediatamente adiacenti all’N-terminale di gp41 e il peptide di fusione con 3 eliche C-terminali che chiudono l’estremità C-terminale dI gp41 posizionate al di fuori del core ed orientate in maniera antiparallela rispetto alle eliche N-terminali [19]. (Figura 12 e 13).


Figura 12. Struttura di una micella legata al dominio di fusione della glicoproteina gp41 dell’HIV. PDB 2ARI struttura NMR.




Figura 13. Rappresentazione del dominio di fusione della gp41.
4. recettori CD4, CCR5 e CCX4 e loro ligandi.
L’ ingresso virale può essere inibito da importanti inibitori delle interazioni gp120-CD4 come accade con la molecola NSC13778 e altri in sperimentazione clinica. Piccole molecole antagoniste dei recettori per le chemochine agiscono come inibitori dell’ingresso dell’HIV, queste interagiscono sia con il corecettore CXCR4 come la chemochina SDF1-α, sia con il corecettore CCR5 il cui legando naturale è MIP1- α e β e farmaci sperimentali come SCH-C [20].

L’interazione tra la gp120 del virus HIV 1 e il recettore CD4 è molto specifico e, secondo le analisi di struttura cristallografica, implica un contatto relativamente piccolo sulla superficie di entrambe le proteine (figura 14). Questa interazione molecolare rappresenta un eccellente target per farmaci antivirali. Nello studio effettuato da Quan-en Yang et al ha dimostrato che un gruppo di piccole molecole contenente antimonio pentavalente, NSC-13778 (Figura 15) e suoi analoghi, esercita un potente effetto anti HIV. I composti competono con gp120 con il legame al CD4. NSC-13778 lega un doppio dominio N-terminale nella proteina CD4 mediante residui di triptofano ed evita il contatto tra il gp120 e CD4 e rappresenta quindi il prototipo di una nuova classe di inibitori dell’ingresso del virus [21].

La struttura monomerica di SDF1 alfa (stromal cell-derived factor-1alfa), ligando naturale per il recettore associate a proteina G CXCR4 è stata studiata con spettroscopia NMR . Usando vari peptici derivati dalle porzioni extracellulari N-terminali del recettore CXCR4 si è visto che i principali determinanti del legame risiedono nei 17 residui N-terminali di CXCR4 con un contributo maggiore che deriva dai primi 6 residui sono stati determinati i principali siti di legame nel tratto comprendente. Durante l’interazione della chemochina SFD-1 si assiste a spostamenti chimici nella porzione di recettore a livello dei residui N-terminali da un lato ed eliche C-terminali da un altro [22] (Figura 16).

Mip 1 beta è un membro della famiglia delle chemochine capace di legare il recettore delle chemochine e quindi capace di inibire l’ingresso dell’HIV. Il residuo amminoacidico per il legame con il recettore è Phe-13 che quando è mutato riduce la capacità di legame di più di 1000 volte per comprendere gli effetti dell’assenza di tale residuo in MIP1 beta è stata dimostrata la struttura tridimensionale tramite NMR. Si è osservato che mentre la proteina originaria formava un dimero, la forma mutata rimaneva monomero fino ad alte concentrazioni portando a significative cambiamenti negli spettri NMR. Questo fenomeno suggerisce che per o sviluppo di nuovi farmaci anti –CCR-5 potrebbero includere molecole che contengono amminoacidi simili alla fenilalanina [23] (Figura 17).

Il primo stadio dell’ingresso dell’HIV nella cellula è un possibile target dei farmaci ed è dipendente dall’interazione tra CD4 e gp120 e il recettore per le chemochine CCR5. La naturale assenza genetica in individui sani ha un effetto poco rilevante per quanto riguarda la risposta immune mentre diviene un fattore di protezione contro le infezioni da HIV. Il knockout di CCR5 in topi ha un inizia solamente con una scarso effetto sulla risposta immune perciò un antagonista specifico di CCR5 potrebbe causare alcuni effetti collaterali basati sul meccanismo. Molti inibitori dell’ingresso dell’HIV mediato da CCR5 si sono dimostrati prevenire l’infezione in vitro. Quesi includono chemochine modificate, anticorpi monoclonali e una piccola molecola antagonista TAK779 che lega una cavità presente nei domini transmmbrana di CCR5. Sono state descritte le proprietà di SCH-C, una piccola molecola inibitrice dell’ingresso del virus HIV attraverso il corecettore CCR5. SCH-C, un composto oxima-piperidina (figura 18), è uno specifico antagonista di CCR5. questo composto inibisce specificamente l’infezione da HIV mediata da CCR5 in cellule di astroglioma ma non ha alcun effetto sull’infezione delle cellule che esprimono CXCR4. SCH-C ha potente attività antivirale in vitro contro colturali HIV isolato che usa CCR5 come corecettore per l’ingresso. Inoltre il farmaco inibisce la replicazione del virus. Promette di essere un nuovo candidato per l’intervento terapeutico nell’infezione da HIV [24].

Gli inibitori della fusione sono una categoria di farmaci scoperti di recente di cui, al momento, l'unico esponente approvato dalla FDA è l'Enfuvirtide che determina il blocco del processo di fusione del virus con la membrana della cellula ospite.

Una terapia antiretrovirale efficace per trattare individui affetti da HIV potrebbe fallire per tante ragioni inclusa la selezione di mutazioni geniche che conferiscono resistenza ai farmaci antiretrovirali, scarsa aderenza o interruzione del trattamento per tossicità da farmaco.

L’Enfuvirtide ha un unico meccanismo d’azione che impedisce l’ingresso di HIV nella fase di fusione della membrana. La potente attività antivirale, i profili di sicurezza e tollerabilità sono stati dimostrati in combinazione con altri agenti. Questo nuovo meccanismo d’azione offre una bassa incidenza di resistenza crociata con la classe convenzionale di farmaci antiretrovirali; la distribuzione extracellulare indica che le interazioni tra farmaci e il metabolismo intracellulare seguono strade diverse [25].

Quando HIV sta per legarsi al recettore della cellula ospite, si assiste ad un cambiamento conformazionale di gp41 che culmina nella formazione di una struttura a tre foglietti β che funziona da ponte tra il virione e la cellula da infettare.

Gp41 probabilmente si trava in una conformazione in cui la regione NHR delle tre molecole di gp41 è in alfa elica posizionando i peptici di fusione nell’inserzione della membrana di fusione.



Figura 20. Le conformazioni della gp 41 dell’HIV prima, durante e dopo la fusione delle membrane virale e della cellula ospite.

L’enfuvirtide è un peptide lineare costituito da 36 amminoacidi sintetici capaci di inibire l’ingresso del virus nella cellula tramite il cambiamento transitorio conformazionale della porzione della glicoproteina gp41 presente sulla superficie dell’envelope, che determina un blocco della regione amino-terminale della gp41 ed impedisce la formazione dei tre foglietti [26].

L’enfuvirtide, in combinazione con altri agenti retrovirali, è indicato nel trattamento di pazienti con infezioni da HIV di tipo 1 quando altri trattamenti sono falliti. Altri peptici ad azione simile includono T-1249 che deve ancora essere approvato ed è in corso di sperimentazione clinica (figura 21).



Figura 21. Inibitore delle fusione: meccanismo d’azione. Enfuvirtide (T-20) è un peptide costituito da 36 amminoacidi che legano la porzione extracellulare della glicoproteina gp41 presente nell’envelope del virus prevenendo il completo cambio conformazionale che è richiesto per la fusione e l’entrata del virus nella cellula.

Le membrane lipidiche giocano un ruolo chiave nel meccanismo d’azione biochimico dell’enfuvirtide [27].

Malgrado gli studi e i trials clinici siano positivi e promettono bene tanto da portare ad una rapida approvazione da parte della FDA per uso clinico, il meccanismo d’azione del Fuzeon (Enfuvirtide) non è stato ancora chiarito a livello molecolare.

La presenza di residui di triptofano nell’enfuvirtide permette di utilizzare tecniche di fluorescenza per provare e testare questa molecola senza bisogno di derivati chimici [28].

A causa delle caratteristiche anfipatiche delle membrane, l’enfuvirtide può interagire con le membrane biologiche.

La diffusione dell’enfuvirtide fluorescente all’interno delle membrane lipidiche è relativamente elevata e modulata dal colesterolo che lo rende disponibile per l’interazione con gp41. Non si assiste a nessuna limitazione che previene o blocca il farmaco dal legame sia a livello nel mezzo acquoso dove esplica la sua azione farmacologia, sia nelle membrane lipidiche che costituiscono una sorta di riserva del farmaco stesso [29].

Diversamente da altri peptici basati sulla regione C terminale di gp 41, l’enfuvirtide manca della sequenza di 8 amminoacidi (628-635) essenziali per l’associazione con la regione N-terminale.

L’enfuvirtide si inserisce nello strato più esterno del plasmalemma (lipidi non carichi) e resiste allo spostamento mediato dalla repulsione dei lipidi carichi negativamente dello strato più interno. Quando l’HIV sta per legare la cellula bersaglio, le modificazioni che avvengono a livello della membrana lipidica del virus potrebbero rimuovere il farmaco; ciò non accade in quanto l’Enfuvirtide è trattenuto dal colesterolo. D’altro canto per la capacità della membrana di interagire con il farmaco potrebbe limitare l’interazione con la gp41.

E’ stato dimostrato che l’equilibrio di ripartizione tende a stabilizzare l’Enfuvirtide nel mezzo acquoso quando avviene il legame a gp41 mentre il suo accumulo nelle membrane cellulari rappresentano solo delle riserve che lo rendono prontamente disponibile per le successive interazioni con i segmenti interessati della gp41, migliorando l’efficienza di inibizione della fusione.

In particolare il meccanismo d’azione sembra essere secondario al legame dell’Enfuvirtide con regioni ricche di leucina e isoleucina.

L’evoluzione genetiche di gp41 rivela un’importante esclusiva relazione tra i codoni 36-38-43 in gp41 durante il trattamento cronico nella terapia con Enfuvirtide.

E’ possibile analizzare i cambiamenti genetici nella proteina gp41 in pazienti affetti da HIV con viremia plasmatica conclamata che ricevono un trattamento a lungo termine con Enfuvirtide nello studio di Carbrera et al sono stati presi in esame 13 casi in cui le sostituzioni in gp41 sono state analizzate attraverso sequenze di base dopo l’inizio del trattamento con Enfuvirtide sono state inoltre investigate le sequenze in evoluzione di cloni multipli di gp41 provenienti da 4 pazienti selezionati. Si è osservato che le mutazioni nelle posizioni 36-38 di gp41 emergono rapidamente (con una media di 10 settimane ) ma scompaiono successivamente nella maggior parte dei pazienti. I cambiamenti amminoacidici non si accumulano nel tempo e non si hanno pazienti con più di 2 mutazioni dopo 6 mesi di trattamento. La mutazione del codone 43 non è osservata insieme ai cambiamenti 36 e 38. l’analisi dei cloni mostra lo sviluppo indipendente di popolazioni virali con mutazioni differenti. Da questo si evince una forte correlazione con la resistenza all’Enfuvirtide associata a mutazioni che suggerisce come l’evoluzione genetica della gp41 sia un processo dinamico e più complesso di quanto si pensi [30].

Essendo l’Enfuvirtide essendo un peptide non può essere assunto per bocca. Il farmaco è somministrato mediante 2 iniezioni sottocutenee giornaliere a distanza di 12ore.

Ogni fiala contiene 90 mg di Enfuvirtide. Il più comune effetto collaterale è la reazione al sito di iniezione. Associato a terapia antiretrovirale, riduce in modo significativo i livelli plasmatici dell’RNA HIV-1 fino a 48 settimane [31].

L’Enfuvirtide presenta un piccolo volume di distribuzione (5.48l), ridotta clearance sistemica (1.4l/h) ed un alto legame alle proteine plasmatiche (92%).

Meno del 17% dell’Enfuvirtide è convertita in una forma deaminata minimamente attiva. Dopo somministrazione sottocutanea,

L’Enfuvirtide è quasi completamente assorbita. La biodisponibilità è alta ( 84.3% ) con un’emivita di eliminazione di 3.8 ore, cosa che giustifica la doppia somministrazione giornaliera. La clearance dell’Enfuvirtide è influenzata, in misura minore, dal sesso e dal peso corporeo, ma non necessita di aggiustamenti posologici.

L’Enfuvirtide ha una bassa potenzialità di interagire con i farmaci che vengono somministrati in modo concomitante. L’Enfuvirtide non influenza la concentrazione dei farmaci metabolizzati dal citocromo P450 (CYP) 3A4, CYP2D6 ed ha solo un minimo effetto sui farmaci metabolizzati da CYP1A2, CYPE1 o CYP2C19.

20 Rusconi S, Scozzafava A, Mastrolorenzo A, Supuran CT. New advances in HIV entry inhibitors development Curr Drug Targets Infect Disord.;4(4):339-55. 2004.

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