Ana səhifə

YÜRÜTÜlmekte olan ab projelerine iLİŞKİn biLGİ formu 1- başvuru sahibi kurum-kuruluş


Yüklə 57.95 Kb.
tarix24.06.2016
ölçüsü57.95 Kb.

YÜRÜTÜLMEKTE OLAN AB PROJELERİNE İLİŞKİN BİLGİ FORMU

1- BAŞVURU SAHIBI KURUM-KURULUŞ

Proje yürütücüsü : Prof.Dr.Süheyla OZBEY(Hacettepe Üniversitesi) , Proje araştırmacısı: Yrd.Doç.Dr. Figen ÇALIŞKAN (Eskişehir Osmangazi Üniversitesi)


2- PROJE ADI –REFERANS NO

Nörotoksik Peptid Acra3 Proteininin Androctonus crassicauda (Türk Siyah Akrebi) Akrep Zehirinden Saflaştırılması, Kristalleştirilmesi ve Kristal Yapısının Aydınlatılması

TÜBİTAK PROJE NO: 110T865




3-HIBE PROGRAMI ADI VE SÖZLEŞME MAKAMI

TÜBİTAK 1001 DESTEK PROGRAMI / TÜBİTAK, HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ve ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ


4-UYGULAMA YERI

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ve ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ


5-PROJE SÜRESI ve PLANLANAN BAŞLANGIÇ-BITIŞ TARIHI

24 ay / Başlangıç: 01.01.2011, Bitiş: 01.01.2013


6-PROJE ORTAKLARI

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ve ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ


7-PAYDAŞLAR




8-PROJE ÖZETİ

Akrep zehirleri iyon kanallarını etkileyen polipeptidler, çeşitli enzimler ve bazı proteaz inhibitörler ile biyolojik aminleri içerirler. Akrep zehirlerinin bileşenleri içinde en çok çalışılan grup, iyon kanallarının karakterizasyonu ve tanımlanmasında oldukça güçlü ve spesifik bir araç olarak kullanılan polipeptidlerdir. Ayrıca polipeptidler protein mühendisliğinde moleküler iskelet, ziraii mücadelede biyopestisid ve akrep zehirlenmelerine karşı aşı olarak geliştirilmiştir. Çeşitli akrep türlerindeki çok farklı peptitlerin varlığı gösterilmesine karşın bu toksinlerin çok azı tanımlanabilmiştir.

Yeni toksin sekanslarının tanımlanması ve onların fonksiyonel bölgelerinin ve yapısal özelliklerinin belirlenmesi medikal ve ticari uygulamaları kadar bilimsel araştırmalarda da büyük ilgi görmektedir. Bugün artık çeşitli akrep nörotoksinlerinin üç boyutlu yapısı özellikle X-Işınları analizi ve NMR ile saptanabilmektedir. Akrep zehirlerinin yapı-fonksiyon analizi için veri tabanı olan SCORPION2 (http://sdmc.i2r.a-star.edu.sg/scorpion) bağlanma afiniteleri ve toksisite bilgileri ile de zenginleştirilmiş 800 ’den fazla doğal ve mutant toksin sekansları ile 624 üç-boyutlu yapı kaydını bulundurmaktadır.

Bilinen 1500 farklı akrep türünden, Buthidae familyasına ait yaklaşık 50 tür insanlar için tehlikelidir ve bu türlerin çoğunluğu da Androctonus, Leiurus, Buthus, Parabuthus, Tityus, ve Centruroides sınıfındandır. Türkiye’de sık görülen ve insan sağlığı için en tehlikeli türlerin Androctonus crassicauda, Leiurus quinquestriatus, Mesobuthus gibbosus ve Mesobuthus eupeus) olduğu belirtilmektedir.

Androctonus crassicauda Türkiye'nin etnomedikal ve toksikolojik öneme sahip Güneydoğu Anadolu akreplerinden birisidir. Venom bileşenleri hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Günümüze kadar bu akrebin venomundan sadece Acra1 ve Acra3 olarak adlandırılan iki peptid izole edilmiş ve tanımlanmıştır. Yakın zamanda bu zehirden yeni bir nörotoksik peptid saflaştırılmış ve Acra3 olarak isimlendirilmiştir. Acra3’ün molekül ağırlığı 7.620,3 Da’ dur ve 66 amino asit rezidüsü ile uzun zincirli bir polipeptittir . Bu tür peptitler doğrudan Na+ kanallarını etkiledikleri için akrep zehirlenmelerinde gelişen nörotoksik semptomlardan sorumludurlar.

Na+ kanallarını etkileyen akrep toksinleri hakkındaki çalışmalar, medikal önemleri ve farmakolojik etkilerinin moleküler düzeyde tanımlanmasına karşı oluşan ilgi nedeniyle son derece dikkat çekmektedir. Bu toksinlerin bağlanma özelliklerindeki farklılıklar, reseptör konumlarında olduğu gibi fonksiyonel yüzeylerinde de heterojenliğe yol açar. Bu nedenle, onların üç-boyutlu molekül ve kristal yapılarının aydınlatılması ve bağlanma özellikleri ile ilişkisinin kurulması seçimli ilaç ve insektisidlerin tasarımı, özgün antivenomların geliştirilmesi için çok değerli bilgiler sağlamaktadır. Ancak sadece akrep zehirlerinin proteinlerinin değil, hiçbir biyolojik makromolekülün bugüne değin ülkemizde X-ışınları kristalografisi ile üç boyutlu kristal yapı analizi çalışması yapılmamıştır.



Sunulan bu proje kapsamında, Androctonus crassicauda akrep zehirinden elde edilecek ve saflaştırılacak nörotoksik peptitlerden öncelikle Acra3’ün moleküler ve kristal yapısı aydınlatılacaktır. Bu amaçla, Dr. Figen Çalışkan tarafından yüksek oranda saf (%99) ve konsantre olarak üretilen liyofilize edilmiş peptid, kristalleştirme amacıyla kullanılacaktır. Enzimin tek kristalleri çeşitli yöntemlerle elde edilmeye çalışılacaktır. X-Işınları difraksiyonu için uygun kristaller büyütüldüğü takdirde, bir Sinkrotron merkezinin (ESRF, Fransa veya Diamond, İngiltere) protein kristalografi demet hattında yapı çözümü için gereken difraksiyon şiddet verileri toplanarak proteinin üç boyutlu yapısı Hacettepe Üniversitesi Kristalografi Laboratuvarında çözülecek, yapı-fonksiyon ilişkisi ve biyolojik aktivitesinin temelleri araştırılacaktır.


8.1. PROJENİN AMACI

Bu projenin temel amacı, Ülkemizin Güneydoğu Anadolu bölgesinde yaygın olarak görülen ve ölümcül zehirlenmelere neden olan Androctonus crassicauda türü akrep venomundan Acra3 adlı toksik peptitin saflaştırılması, kristalize edilerek X-ışınları difraksiyonu ile atomik düzeyde molekül ve kristal yapısının belirlenmesidir. Böylece, amino asit diziliminden başlayarak, alfa-helis, beta tabakaları ve döngüler gibi ikincil yapıyı tanımlayan yapısal özelliklerin yanında, molekülün atomik düzeyde üç boyutlu yapısının ve moleküler kümelenmeyi tanımlayan dördüncül yapısının kesin olarak aydınlatılması sağlanacaktır.Anadolu pek çok hayvan ve bitki çeşitliliğine sahip olduğu kadar venom çeşitliğine de sahiptir. Ne yazık ki ülkemizde hayvan venomları ile ilgili çalışmalar çok sınırlı sayıdadır. A.crassicauda ham venomunda bulunan toksik peptidlerin üç-boyutlu kristal yapılarının bilinmesi, bu moleküllerin fonksiyonu ve reseptör bağlanma özellikleri hakkında yeni bulguların elde edilerek yapı-aktivite ilişkilerinin açıklanabilmesine, bu türe özgü yeni ilaçların tasarımına ve aşıların geliştirilmesine ışık tutacaktır. Bu çalışma sonucu elde edilecek bulguların zehirlenmelerdeki iyileştirme yöntemlerine katkı sağlaması beklenmektedir.


8.2. PROJENİN HEDEF KİTLESİ

Türkiye’de özellikle Güneydoğu Anadolu bölgesinde ve Ortadoğu ülkelerinde yaygın olarak görülen, etnomedikal ve toksikolojik olarak önemli akrep türlerinden bir tanesi Androctonus crassicauda’dır. Bu türün zehirlerinin içeriğine ait çok az bilginin olduğu literatürden anlaşılmaktadır. Hedef, toksin yapının anlaşılması ile iletimde kullanılabilmesidir.

8.3.ANA FAALİYETLER

Önerilen araştırma kapsamında öncelikle Acra3 ham venomdan saflaştırılacak, daha sonra Acra3’ün molekül ve kristal yapısı x-ışınları difraksiyon tekniği ile aydınlatılacaktır. Çalışmaların birinci adımında Dr. Çalışkan tarafından yüksek saflıkta (%99) ve konsantrasyonda elde edilen ve liyofilize edilerek düşük sıcaklıkta saklanan Acra3 peptiti çeşitli kristalizasyon teknikleri kullanılarak kristalleştirilecektir. Uygun peptit kristalleri seçilerek döner anot x-ışını kaynağı ile veya Avrupa’daki bir sinkrotron merkezinde (ESRF, Fransa veya Diamond, İngiltere) bulunan protein kristalografisi demet hattında yüksek akılı ve şiddetli X-ışınları kullanılarak difraksiyon şiddet verileri elde edilecektir. Bu verilerin iş istasyonlarında büyük yazılım ve görüntüleme programları kullanılarak analizi ile proteinin üç boyutlu yapısı çözülecektir. İyi kalitede bir kristal ve kesin üç boyutlu yapı ile peptit molekülünün biyolojik işlevinin çok hassas olarak belirlenebilmesi mümkündür. Acra3 peptidinin üç boyutlu yapısının bilinmesi ancak yukarıda belirtilen parametrelerin gerçekleştirilmesi ile mümkün olacaktır.


8.4.BEKLENEN SONUÇLAR

Akrep venomlarında var olduğu düşünülen yaklaşık 100.000 farklı peptidin %1’inden daha azı bilinmektedir. Son yirmi yılda dünyada akrep zehirlerinden proteinlerin ve genlerin izolasyonu ve karakterizasyonu ile oldukça önemli bilgi birikimi oluşmuştur. Ancak, Ülkemizde yaşayan akrep türlerinin zehirlerinde bulunan proteinlerin bileşenlerinin varlığının ve büyüklüklerinin biyokimyasal tekniklerle tanınması, toksik etkileri için hayvan deneylerinin yapılması gibi az sayıda çalışmanın dışında, bu bileşenlerin izole edilmesi, saflaştırılması ve farmakolojik özelliklerinin belirlenmesi için daha ileri ve kapsamlı çalışmalara rastlanmamıştır. Oysa, biyokimyasal ve farmakolojik bilgiler, zehirin etki mekanizmalarının bilinmesi özel panzehirlerin üretilmesi ve geliştirilmesi açısından son derece önemlidir. Acra3 peptidi, ortak çalışma grubumuzun ön çalışmaları sonucu belirlenmiş bir moleküldür. A. crassicauda akrebi ham venomundan saflaştırılan 3. peptid olması nedeni ile Acra3 adı verilmiş ve uluslararası literatürledeki toksin filogenetik ağacında yerini almış, biyoinformatik veri tabanlarında listelenmiştir. Acra3 peptidi ile immunize edilen farelerden Acra3'e spesifik bağlanan monoklonal antikorlar elde edilmiştir. Ayrıca, Acra3 peptidi ile immunize edilen farelerden elde edilen poliklonal antikorların ise ham venomu nötralize etme yeteneğine sahip olduğu belirlenmiştir (TÜBİTAK 106T527 nolu proje). Bu sonuçlar farmakolojik açıdan Acra 3 peptidinin önemli bir molekül olduğunu ortaya çıkarmıştır.
Öte yandan, bu proteinlerin biyolojik aktivitelerinin yapısal temellerinin anlaşılması, farklı biyolojik aktivitelerden sorumlu bölgelerinin belirlenebilmesi için üç-boyutlu molekül ve kristal yapılarının bilinmesine ihtiyaç vardır. Bilindiği gibi protein ve enzimlerin fonksiyonları doğrudan onların üç boyutlu yapısı ile ilişkilidir. Bu nedenle Acra3 peptidinin üç boyutlu kristal yapısının tanımlanması, etkin anti-venomun tasarımı ve elde edilmesi için de önemli bir adım olacaktır. Ancak Protein Veri Bankası ve literatür araştırıldığında A. Crassicauda da dahil Türk akrep türlerinden izole edilmiş protein ve peptitlerin gerek NMR, gerekse X-ışınları difraksiyonu ile yapılmış üç boyutlu yapı analizi çalışmasına rastlanmamıştır. Bu proje ile de ilk kez uluslarası literatüre, A. Crassicauda türüne ait akrepten elde edilmiş nörotoksik Acra3 peptidinin molekül ve kristal yapı bilgisi kazandırılacaktır.
Ayrıca, dünyada çeşitli akrep toksinlerinin bazılarının kristal yapıları belirlenmiş olmasına rağmen, onların spesifik farmakolojik özellikleri ile bağlantılı olabilecek özgün parametreler henüz tanımlanabilmiş değildir. Bu nedenle, yeni özelliklere sahip yeni protein yapılarının, yapı-fonksiyon ilişkisinin belirlenmesine yardımcı olacağı açıktır.



8.5.TOPLAM BÜTÇE

139.765,00 TL




TAMAMLANMIŞ HİBE PROJELERİNE İLİŞKİN BİLGİ FORMU

1- BAŞVURU SAHIBI KURUM-KURULUŞ

Proje yürütücüsü : Prof.Dr.Yalçın ŞAHİN, Proje araştırmacısı: Yrd.Doç.Dr. Figen ÇALIŞKAN

2- PROJE ADI –REFERANS NO

Androctonus crassicauda Türü Akrep Venomundan Peptid Toksin (Acra 3) Saflaştırılması ve Klonlanması, Hücre Kültüründe Biyokimyasal ve Morfolojik Etkilerinin Araştırılması ve Acra3 Antijenine Karşı Fare Monoklonal Antikorlarının Geliştirilmesi

TÜBİTAK PROJE NO: 106T527




3-HIBE PROGRAMI ADI VE SÖZLEŞME MAKAMI

TÜBİTAK 1001 DESTEK PROGRAMI / TÜBİTAK, ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ


4-UYGULAMA YERI

ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ

5-PROJE SÜRESI ve PLANLANAN BAŞLANGIÇ-BITIŞ TARIHI

36 ay / Başlangıç: 01.01.2007, Bitiş: 01.01.2010


6-PROJE ORTAKLARI

ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ, MEKSİKA ULUSAL OTONOM ÜNİVERSİTESİ



7-PAYDAŞLAR




8-PROJE ÖZETİ

Akrep venomları (zehirleri), yüksek ilgi ve özgünlük ile membran reseptörleri ve iyon kanallarını etkileyebilen memeli, böcek ve kabuklulara toksik olan peptidler içerir. Bu toksinlerin uyarılabilen/uyarılmayan hücrelerdeki özellikle Na+, K+, Ca2+ ve Cl- kanallarını etkileyen dört farklı familyası tanımlanmıştır. Androctonus crassicauda türü akrepler ülkemizin güneydoğu bölgesinde ölümle sonuçlanan akrep zehirlenmelerine neden olmaktadır. Zehirlenmenin tedavisinde A. crassicauda ham venomu ile bağışıklık kazandırılmış atların serumundan elde edilen anti-venom uygulanmaktadır. Bu tip Anti-venomların uygulamasından sonra alerjik reaksiyonlar ve anafilaktik şok gelişebilmektedir. Günümüzde monoklonal antikorların kullanımı etkinliği, üretimi ve kontaminantlardan arındırılmış olması ile önemli avantajlar sunabilmektedir. Monoklonal antikor üretiminde öncelikle etkin antijenin saf olarak elde edilmesi gereklidir.

Bu çalışma, başlıca 3 aşamadan oluşmaktadır. İlk aşama A.crassicauda ham venomunun içerdiği ve Acra3 olarak adlandırdığımız peptidinin yapısının belirlenmesini içermektedir. Bu amaçla akrepler toplanarak deneyler süresince laboratuarda besleneceklerdir. Venomlar ayda bir kez olmak üzere elektrostimülasyonla toplanacaktır. Ham venomun içerdiği peptidlerin izolasyonu sonrasında, öldürücü etkili bileşen (Acra 2) yüksek performans sıvı kromatografisine (HPLC) uygulanarak karışımdan ayrıştırılacaktır. Peptidin saflık derecesi SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi)‘de kontrol edilecek, KS (kütle spektrofotometresi)’de molekül ağırlığı belirlenecek ve protein sekansırda aminoasit dizilimi elde edilecektir. Ayrıca rekombinant DNA tekniği kullanılarak Acra3 peptidinin gen kodları klonlanacaktır.

İkinci aşamada, A.crassicauda ham venomu ve Acra3’nin fibroblast ve miyoblast hücrelerinin canlılığı ve çoğalması üzerine etkilerinin belirlenmesi için MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ) testi ve ortamın sialik asit düzeyi belirlenecektir. Hücrelerden salınan LDH (laktat dehidrojenaz) ve CK (kreatin kinaz) toplam aktiviteleri sitotoksisitenin belirleyicisi olarak ölçülecektir. Ham venom ve Acra3’nin fibroblast ve miyoblast hücrelerinde neden olduğu hücresel ölümün mekanizması nekroz ya da apoptoz varlığı ile araştırılacaktır. Morfolojik incelemelerde, akridin-oranj/etidyum bromür ile boyama yapılacak ve floresan mikroskobu ile görüntülenecektir. Venomun farklı konsantrasyonları ile inkübe edilen hücrelerde, kaspaz 3 ve 9’un aktivasyonu ELISA yöntemi ile ve zar bütünlüğü floresan işaretli FITC-Annexin V boyaması ile belirlenerek apoptozun varlığı araştırılacaktır.

Çalışmanın üçüncü aşamasında, Acra3 toksinine karşı monoklonal antikor geliştirilecektir. Bu amaçla BALB/c fareleri bir antijen olarak saflaştırılan Acra3 nin değişen miktarları ile immünize edileceklerdir. Üç kez bağışıklama sonrası farelerin dalağından elde edilen hücreler kullanılarak hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikor üreten hibrit hücreler geliştirilecektir. Proje kapsamında elde edilecek Acra3 monoklonal antikorları daha sonraki çalışmalarda immünafinite kolon kromatografisinde kullanılabilecektir. Ayrıca bu proje kapsamında laboratuarımızda hibridoma teknolojisi rutin kullanıma geçirilecek ve bir sonraki projeler kapsamında Acra3’ye karşı insan monoklonal antikorlarının yapılabilmesi için teknik ve teorik bilgi birikimi oluşturacaktır.



Proje ekibimiz, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünden Prof. Dr. Yalçın ŞAHİN, Dr. Ferhan KORKMAZ, Uzm. Figen ÇALIŞKAN ve Tıp Fakültesi Biyokimya Bölümünden Doç. Dr. Güngör KANBAK ile Anadolu Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümünden Doç. Dr. Hülya SİVAS (ZEYTİNOĞLU) ve Dr. Emel ERGENE’ den oluşmaktadır. Ayrıca, Projede Acra3’nin yapısının belirlenmesi çalışmalarında UNAM (National Autonomous University of Mexico) Biyoteknoloji Enstitüsü, Moleküler İlaç ve Biyoproses bölümünden Prof. Dr. Lourival Domingos POSSANI ayrıca Acra3’ye karşı monoklonal antikor geliştirilmesi çalışmalarında TÜBİTAK, Marmara Araştırma Merkezi– Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü’nden Doç. Dr. Aynur BAŞALP danışman olarak yer alacaktır. Önerilen bu proje belirtilen dört bölümün laboratuarlar olanakları ve TUBİTAK ‘ın vereceği destek kullanılarak 36 ay içerisinde gerçekleştirilecektir.


8.1. PROJENİN AMACI

Bu projenin amacı etkin anti-venom (anti-serum) hazırlamak üzere; A. crassicauda türü akrebinin Acra3 olarak adlandırılan öldürücü etkiye sahip peptid bileşeninin birincil yapısının belirlenmesi, ham venom ve Acra3’ nin toksisite mekanizmasının araştırılması ve ayrıca bu etkin antijene karşı monoklonal antikor üretimidir. Antivenomlar akrep venomuna karşı bağışıklık kazandırılmış hayvanlardaki (at, keçi gibi) hetero poliklonal immunoglobulin ya da F(ab')2 fraksiyonlarıdır. Ülkemizde anti-serum eldesinde yalnız A.crassicauda venomundan yararlanılmaktadır. Bu venom ile hazırlanmış serum sahip olduğu polivalan karakteri nedeniyle ülkemizdeki tüm diğer akrep zehirlenmesi tedavilerinde de kullanılmaktadır. İnsan tedavisinde farklı canlılarda hazırlanmış serumlar istenmeyen bazı immünolojik reaksiyonlara neden olabilmektedir. Bu sorunu ortadan kaldırmada en etkili çözüm insan antikorlarının kullanılmasıdır. Proje kapsamında öncelikle Acra3 ‘ye karşı fare monoklonal antikorları geliştirilecek, Elde edilecek monoklonal antikorlar gerek Acra3’nin hızlı tanısı için ELISA testinde gerekse Acra3’nin saf olarak elde edilebimesi için immünafinite kolon kromatografisinde kullanılacaktır. Acra3 bileşeninin yapısal analizi ise etkin anti-venom çalışmaları için bir basamak oluşturacaktır. Anti-venomlar venom etkisini nötralize etmelerine karşın pek çok klinik belirtiye karşı etkisiz kalabilmektedir. Venomun etki mekanizmasının belirlenmesi amacıyla biyokimyasal ve morfolojik etkileri hücre kültüründe araştırılacaktır. Elde edilecek sonuçların zehirlenmelerdeki iyileştirme yöntemlerine yardımcı olması beklenmektedir. Özellikle projede monoklonal antikor elde etmek üzere hibridoma teknolojisinin rutin uygulanır hale gelmesiyle de bir sonraki projeler kapsamında Acra3’ye karşı insan antikorları geliştirilmesi de uzun vadeli hedeflerimiz arasında yer almaktadır.


8.2. PROJENİN HEDEF KİTLESİ

Akrep zehirlenmelieri sonrasında iyiletime gereksinim duyan kişiler.

8.3.ANA FAALİYETLER

Önerilen bu çalışma, Türkiye’nin güneydoğu bölgesinde, ölümcül zehirlenmelere yol açan A.crassicauda türü akrebinin ham venom ve daha önceki çalışmalarımızda Acra3 olarak adlandırdığımız öldürücü etkiye sahip peptid bileşeninin birincil yapısının ve toksisite mekanizması belirlenmesi, ayrıca bu etkin antijene karşı monoklonal antikor üretimi olarak planlanmıştır. İlk olarak toplanacak olan akreplerden venom elde edilerek Acra3 saflaştırılacaktır. Saf haldeki öldürücü bileşen Acra 2 peptidinin molekül ağırlığı ve aminoasit dizilimi ortaya konulacaktır. Bu sonuçlardan gidilerek rekombinant DNA tekniği ile Acra3’yi sentezleyen gen klonlanacaktır. Venom ve bileşenin, fibroblast ve miyoblast hücreleri üzerine olan toksik etkileri biyokimyasal ve morfolojik olarak araştırılacaktır. Hibridoma teknolojisi kullanılarak Acra3’ye karşı monoklonal antikorlar geliştirilecektir.

Önerilen araştırma kapsamında akrepler toplanarak ham venom elde edilecektir. Lethal etkili Acra3 peptidinin birincil yapısının belirlenmesi için sırasıyla; HPLC (yüksek performans sıvı kromatografisi) kullanılarak bileşenler ayrıştırılacak ve Acra3 saf olarak elde edilecektir. SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi) saf peptidin moleküler ağırlığının tesbitinde ve saflığının kontrolünde kullanılacaktır. Elde edilen saf peptidin KS (kütle spektrofotometresi)’de molekül ağırlığı ve protein sekansırda birincil yapısı belirlenecektir. Ayrıca rekombinanat DNA tekniği kullanılarak Acra3 peptidini sentezleyen gen dizilimi belirlenecektir.



Daha sonra, fibroblast ve miyoblast hücre kültüründe A.crassicauda venomu nedeniyle oluşan hücresel ölümün in vitro süreci araştırılacaktır. Bu çalışmalar hem ham venom hemde saflaştırılacak olan öldürücü bileşen Acra3 ile gerçekleştirilecektir. Hücresel ölümün mekanizmasını belirlemek amacı ile nekrozun ya da apoptozisin varlığı araştırılacaktır. Apoptozisin belirlenmesinde kaspaz 3 ve 9’un aktivasyonu araştırılacak, zar bütünlüğü Annexin V boyaması ile belirlenecektir. Hücre canlılığı ve çoğalmasının belirlenmesi için MTT testi ve ortama salınan sialik asit düzeyi ölçülecektir. Hücre zar hasarının belirlenmesi için ortamın LDH ve CK toplam aktiviteleri ölçülecektir. Morfolojik incelemelerde ise akridin-oranj ile boyama yapılacak ve sonuçlar floresan mikroskobu ile görüntülenecektir. Bu çalışma sonucunda, apoptoz varlığının ortaya konulabilmesi için gerekli olan parametrelerin çalışma sonuçları değerlendirilerek birbirleri ile ilişkilendirilecektir. Son aşamada ise, BALB/c fareleri farklı dozlarda Acra3 proteini (antijeni) ile immünize edilecek ve farelerin dalağından elde edilecek lenfositler ile füzyon çalışmaları yapılacaktır. Füzyon çalışmasında klasik hibridoma teknolojisi kullanılarak Acra3’ye karşı monoklonal antikorlar geliştirilecektir. A.crassicauda ham venomu ve Acra3 nin hücre kültüründeki biyokimyasal ve morfolojik etkilerinin belirlenmesi, ham venomun öldürücü bileşeni olan Acra3’ nin yapısının aydınlatılması ve monoklonal antikor üretimi ancak yukarıda verilen parametrelerin gerçekleştirilmesi ile mümkün olacaktır.

8.4.BEKLENEN SONUÇLAR

Gerçekleştirilen bu çalışma ile söz konusu antiserum daha yüksek etkinlikte ve üretim, kullanım olaylığında olacaktır. A.crassicauda, Orta Doğuda geniş alana yayılış gösteren bir türdür. Bu türün dağılımı Türkiye (yalnız Güneydoğu Anadolu), Azerbeycan, İran, Irak, Suriye, Ürdün ve Suudi Arabistan üzerinden Yemen’e kadar olan alanları içerir (Crucitti, 1999). Bu nedenlerle projemizin iyileştirme yöntemlerine ve bilimsel literatüre sağlayacağı katkının yanı sıra monoklonal antikor üretiminin ülkemiz açısından biyoekonomik bir katkı sağlayacağı da düşünülmektedir.

8.5.TOPLAM BÜTÇE

274.000,00 TL



Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©atelim.com 2016
rəhbərliyinə müraciət