Slovenská poľnohospodárska univerzita nitra fakulta biotechnológie a potravinárstva

Určenie obsahu karvakrolu v pamajoránovej silici

Vlastnosti a zloženie pamajoránovej silice sme zistili pomocou plynovej chromatografie, chromatograf typ 8015-91-6. Množstvo kvapalnej vzorky 10 μl sa jednorázovo nadávkovalo cez injektor do prúdu nosného plynu. V injektore sa vzorka zohriala a nosným plynom sa presunula do kolóny. V kolóne sa uskutočnila separácia zložiek zmesi podľa afinity jednotlivých zložiek k stacionárnej fáze. Prvá zložka, ktorá vyšla z kolóny mala najnižšiu afinitu (bola najmenej zadržiavanou stacionárnou fázou). Posledná zložka, ktorá vyšla z kolóny mala najvyššiu afinitu k stacionárnej fáze (najsilnejšie zadržiavaná v kolóne). Výstup rozdelených zložiek zmesi z kolóny bol zaznamenávaný detektorom. Z detektora vychádzal elektrický signál, ktorý bol spracovávaný a vyhodnocovaný softwarovým programom PC zariadenia. Konečným výstupom bol chromatografický záznam (chromatogram), ktorý obsahoval tzv. píky prislúchajúce k jednotlivým zložkám zmesi. Poloha píku na časovej osi chromatogramu (os x) je mierou kvality zložky (identifikácia zložky) v našej vzorke pamajoránovej silice karvakrolu.

Antioxidačná aktivita pamajoránovej silice

Použili sme modifikovanú DPPH metódu podľa Brand-Williamsa et al. (1995) a Sánchez-Moreno et al. (1998). Princípom metódy je redukcia stabilného radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH·) v metanolickom roztoku za prítomnosti antioxidantov, ktorá sa prejavuje poklesom absorbancie pri 515,6 nm. Pokles sme zaznamenávali v stanovených časových intervaloch až do dosiahnutia reakčnej rovnováhy na spektrofotometri Shimadzu 1601 UV-VIS.

Účinnosť silice sme vypočítali podľa vzorca:
% inhibície = [ (A_C0 - A_At) / A_C0] . 100 (1)
A_C0 = absorbancia kontroly v čase t = 0 min. (roztok DPPH∙)

A_At = absorbancia v prítomnosti antioxidantu v čase t min.
Do kyvety na meranie sme napipetovali presne 3,9 ml DPPH∙ (0,025 g.dm^-3 2,2´-difenyl-1-pikrylhydrazylu v metanole), odčítali sme hodnotu absorbancie (A_C0) na UV/VIS spektrofotometri (UV-1601, Shimadzu, Tokyo, Japonsko).

Následne sme pridali 0,1 ml vzorky a zaznamenávali sme závislosť:

Obsah sušiny sme určili vysušovaním vzorky za predpísaných podmienok vážkovo v sušiarni pri teplote 105 °C do konštantnej hmotnosti.

Stanovili sme množstvo celkových cukrov po inverzii vyjadrené ako sacharóza a prepočítané pomocou faktora 0,95. Cukry sme vyextrahovali zriedeným etanolom. Roztok sme vyčírili Carrezovými činidlami I a II. Po odstránení etanolu sme stanovili Luff-Schoorlovou metódou množstvo cukru.

Dusíkaté látky sme stanovili na prístroji Kjeltec 8200 ako celkový obsah dusíka podľa Kjeldahlovej metódy, ktorý sa vynásobil faktorom 6,25. Dusík sme stanovili po prevedení dusíkatých zlúčenín mineralizáciou kyseliny sírovej na síran amónny, z ktorého sa hydroxidom sodným vytesnil amoniak. Amoniak sme spolu s vodnou parou destilovali do predlohy s prebytkom kyseliny, ktorý sme stanovili titračne.

Za tuk sa považujú látky rozpustné v chemickom rozpúšťadle (petroléter) za podmienok Soxhletovej extrakčnej metódy. Tuk sme stanovili pomocou extraktora Det-gras ako zvyšok získaný po rozpúšťadle a vysušením extraktu vzorky vážkovo.

Podstata metódy pozostáva z dvoch stanovení. Pri prvom stanovení sme vzorku upravili zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčírení a filtrácii sme polarimetrickým meraním stanovili optickú otáčavosť roztoku. Pri druhom stanovení sme vzorku extrahovali 40 %-ným etanolom. Po okyslení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčírení a prefiltrovaní sme zmerali optickú otáčavosť rovnakým spôsobom ako pri prvom stanovení. Rozdiel medzi týmito dvoma meraniami vynásobený známym faktorom vyjadril obsah škrobu vo vzorke.

Údaje obsahu živín sa udávajú v g.g^-1 (3)

Aminokyseliny sme určili pomocou automatického analyzátora, typ AAA 400 M. Aminokyseliny sme extrahovali zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu vyextrahované dusíkové makromolekuly sme vyzrážali kyselinou sulfosalicylovou, ktoré sme odstránila filtráciou. Hodnotu pH prefiltrovaného roztoku sme upravili

Kyselinu linolovú sme stanovili podľa metódy založenej na derivatizácii triacylglycerolov mastných kyselín na metylestery a následnom kvantitatívnom stanovení pomocou plynovej chromatografie, chromatograf typ 8015-91-6. Kvantifikáciu metylesteru kyseliny linolovej sme vykonali referenciou na štandard známeho zloženia.

Minerálne látky (popol) sme určili dokonalým spálením vzorky v muflovej peci pri teplote 550 °C do dokonalého spálenia organických látok.

Popol sme uviedli do varu s kyselinou chlorovodíkovou a nerozpustný zvyšok sme prefiltrovali. Roztok sme upravili molybdátovanádovým činidlom. Optickú hustota takto vzniknutého žltého roztoku sme zmerali spektrofotometrom pri 430 nm

Popol sme uviedli do varu s kyselinou chlorovodíkovou a nerozpustný zvyšok sme prefiltrovali. V roztoku popola s kyselinou chlorovodíkovou sme vápnik vyzrážali ako šťavelan vápenatý. Zrazeninu sme rozpustili v kyseline sírovej a vznikajúcu kyselinu šťavelovú sme titrovali roztokom manganistanu draselného.

17. 
    Určenie počtu Lactobacillus sp., Enterococcus sp. a koliformných baktérií v chýmuse slepých čriev
    

18. 
    Zistenie počtu kolónií tvoriacich jednotky
    

Riedenie vzoriek

Pri vyhodnocovaní výsledkov sme použili platňovú zrieďovaciu metódu. Základné riedenie bolo: 1 g chýmu + 99,0 ml fyziologického roztoku (0,85 % NaCl) podľa desiatkového systému riedenia. Základné riedenie (10-1) sme pripravili zmiešaním 5,0 g vzorky a 45,0 ml fyziologického roztoku, prípadne 10,0 g vzorky a 90,0 ml fyziologického roztoku. Zmes sme homogenizovali na trepacom zariadení počas 30,0 min. Zo základného riedenia sme pripravili ďalšie, podľa desiatkového systému riedenia. Vzorky sme očkovali povrchovo alebo zaliatím. Naočkované živné pôdy v Petriho miskách sme kultivovali v termostate dnom nahor. Teplotu a čas sme prispôsobili skupine kultivovaných mikroorganizmov. Po kultivácii sme spočítali kolónie ma miskách. Pre výpočet KTJ.g^-1 sme použili nasledovný vzorec (v ktorom sme brali do úvahy misky z dvoch za sebou idúcich riedení):
N= ∑C/ [(n1 + 0,1n2) . d] (4)
∑C – súčet charakteristických kolónií na vybraných miskách,

n1 – počet misiek z 1. riedenia použitého na výpočet,

n2 – počet misiek z 2. riedenia použitého na výpočet,

d – riediaci faktor zhodný s 1. použitým riedením.

Jednotlivé druhy mikroorganizmov budú hodnotené podľa ich základných identifikačných znakov. Izolované druhy mikroorganizmov a ich základné identifikačné znaky podľa (Holta et al., 1994).

Sú to baktérie s veľkosťou 1,1 až 1,5 . 2,0 až 6,0 µm vyskytujúce sa osamote alebo v pároch. Sú fakultatívne anaeróbne, chemoorganotrofné, majú respiračný a fermentatívny typ metabolizmu. Sú negatívne na oxidázu, pozitívne na katalázu, pozitívne na metyl červeň a obyčajne negatívne na citrát. Nachádzajú sa v tráviacej sústave, špeciálne v živočíšnych a rastlinných produktoch. Sú bežným obyvateľom tráviacej sústavy vtákov a cicavcov (Holt et al., 1994).

Rod Enterococcus

Bunky sú guľatého alebo ovoídneho tvaru, 0,2 až 2,0 . 0,6 až 2,5 µm veľké. Nevytvárajú endospóry. Sú grampozitívne, fakultatívne anaeróbne, chemoorganotrofné, produkujú kyselinu mliečnu. Sú negatívne na katalázu. Obyčajne rastú pri teplote 10 až 45 °C (optimum 37 °C) a pH 9,6, na živnej pôde so 6,5 % NaCl a so 40 % obsahom žlče. Nachádzajú sa v tráviacej sústave, špeciálne v živočíšnych a rastlinných produktoch. Sú bežným obyvateľom tráviacej sústavy vtákov a cicavcov (Holt et al., 1994).

Bunky sú paličkovitého tvaru veľké 0, 5 až 1, 2 . 1, 0 až 10, 0 µm. Obyčajne sú to dlhé paličky, často spojené v retiazkach. Sú to grampozitívne, nesporulujúce bunky. Sú fakultatívne anaeróbne, niekedy mikroaerofilné, v aeróbnych podmienkach majú spomalený rast, ktorý sa zrýchľuje po odstránení kyslíka z prostredia. Sú chemoorganotrofné, ich bunky majú široké požiadavky na komplexné živné média, ich metabolizmus je fermentatívny, sacharolytický. Neredukujú dusičnany, bunky sú negatívne na katalázu. Optimum rastu laktobacilov je 30 až 40 °C. Nachádzajú sa v tráviacej sústave, špeciálne v živočíšnych a rastlinných produktoch, sú bežným obyvateľom tráviacej sústavy vtákov a cicavcov. Sú ojedinelými patogénmi(Holt et al., 1994).

19. 
    Stanovenie mikroskopických húb v kŕmnych zmesiach brojlerových kurčiat
    
    
    

Nahromaďovacie kultúry mikroskopických húb z analyzovaných substrátov sme pripravili na Czapek-Doxovom agare a sladinovom agare s prídavkom 100 mg chloramfenikolu.

Pri identifikácii sme sledovali nasledujúce znaky:

1. 
   kultivačné znaky:
   

• 
  rýchlosť rastu kolónie,
  
• 
  tvar kolónie,
  
• 
  povrch kolónie,
  
• 
  farba kolónie,
  
• 
  tvorba a vylučovanie pigmentu do prostredia,
  
• 
  tvorba exudátov na povrchu kolónie;
  

2. 
   morfologické znaky (pozorované v preparátoch s laktofenolom):
   

• 
  prítomnosť nepohlavných spór, ich tvar, veľkosť, spôsob tvorenia a usporiadania,
  
• 
  typ vegetatívnej fruktifikačnej štruktúry, jej tvar a usporiadanie,
  
• 
  prítomnosť osobitných útvarov (rizoidov, stolónov, chlamydospór, sklerócií a pod.),
  
• 
  prítomnosť pohlavných fruktifikačných štruktúr a spór, ich tvar, veľkosť, usporiadanie.
  
• 
  Identifikáciu jednotlivých rodov, resp. druhov mikroskopických húb sme stanovili podľa kľúčov autorov, Klich (2002), Samson et al. (2002), (Hoog et al., 2000).
  

20. 
    Biochemické ukazovatele krvi
    

Na konci druhého experimentu sme vybrali v každej skupine po 6 kusov brojerových kurčiat o približne rovnakej hmotnosti, ktorým sme odobrali krv.

21. 
    Detekcie a kvantifikácie geneticky modifikovaných pridavkov v krmivách
    

22. 
    Izolácia deoxyribonukleovej kyseliny
    

Navážili sme 200,0 mg vzorky, ktorú sme následovne zhomegenizovali

Do filtračnej skúmavky sme napipetovali 400,0 µl pufru CQW a znovu sme ju centrifugovali po dobu 1 min. pri 11000 otáčkach a následne sme odstránili prefiltrovaný roztok. Do filtračnej skúmavky sme napipetovali 700,0 µl pufru C5 a opätovne sme ju centrifugovali po dobu 1 min. pri 11000 otáčkach a následne sme odstránili prefiltrovaný roztok. Do filtračnej skúmavky sme napipetovali 200,0 µl buffer CQW a opätovne sme ju centrifugovali po dobu 2 min. pri 11000 otáčkach, čím sme úplne odstránili pufor C5.

Filtračnú skúmavku sme uložili do novej 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky a napipetovali sme na jej silicovú membránu 100,0 µl vymývacieho pufru CE (zohriateho na teplotu 70 °C). Následne sme nechali vzorku inkubovat po dobu 5 min. pri izbovej teplote a potom sme ju centrifugovali po dobu 1 min. pri 11000 otáčkach.

Vo vzniknutom supernatante sme získali potrebnú DNA. Podľa tejto metódy postupu bolo pripravených 30 vzoriek kompletných kŕmnych zmesí určených
pre brojlerové kurčatá. Vzorky boli skladované pri teplote -20 °C až do uskutočnenia laboratórnych analýz.

Príprava a laboratórne analýzy všetkých vzoriek boli vykonané v laboratoóriach Katedry hygieny a bezpečnosti potravín Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre.

23. 
    Klasická PCR (end-point PCR) metóda krmív a jej vyhodnotenie na géli
    

Identifikácia deoxyribonukleovej (DNA) geneticky modifikovanej sóje línie 40-3-2 sa vykonala zo vzoriek po skríningu prítomnosti promótora 35S pomocou kitu AmpliSens PLANT SCREEN.

Príprava mikroskúmaviek s reakčnou zmesou pre PCR amplifikáciu DNA

Vybrali sme potrebné množstvo mikroskúmaviek s PCR zmesou 1-R GM Sója 40-3-2 určených na PCR amplifikáciu plus dve mikroskúmavky na kontrolné vzorky a do jednotlivých mikroskúmaviek sme pridali na povrch vosku 10,0 µl PCR zmesi

Pripravili sme aj 2 mikroskúmavky ako kontroly:

1. 
   negatívna kontrola –namiesto DNA sme do mikroskúmavky pridali 10,0 µl TE pufru
   
2. 
   pozitívna kontrola – do označenej mikroskúmavky sme pridali 10,0 µl pozitívnej kontroly DNA sóje dodanej v kite
   

Dĺžka špecifických PCR fragmentov GM sóje línia 40-3-2 bola 274 bp.

Získané PCR produkty sme vizualizovali na 1 %-nom agarózovom géle
pri ultrafialovom svetle (UV transiluminátor) pomocou ethidium bromidu pri 125 V 
po dobu 40 min.

24. 
    Kvantifikácia geneticky modifikovanej zložky v krmivách
    

Použili sme 2 typy primerov. Primery EPSPS sú špecifické pre rastliny s obsahom geneticky upravenej tolerancie na glyfosfát, ktorý je kompetitívnym inhibítorom enolpyruvát-šikimát-3-fosfát syntetázy (EPSPS), ktorý je nevyhnutný

Forward, 5’ –TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGGC- 3’

Reverse , 5’ –CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3’

Hlavnou zložkou pri Go Taq® qPCR Master Mix v objeme bolo 12,5 µl Go Taq qPCR mix, ktorý bol doplnený o 10,875 µl superčistej vody, 0,3125 µl z každého primeru a 1,0 µl DNA, aby bol dosiahnutý celkový objem 25,0 µl.

Finálne predlžovanie fragmetov prebiehalo pri teplote 72 °C po dobu 5 minút. Krivka topenia PCR produktov bola spustená zahriatím vzorky na 95 °C a okamžitým schladením na 65 °C po dobu 15 sekúnd. Vzorka bola zohrievaná rýchlosťou 0,1 °C

Druhým použitým typom primerov boli primery pre chloroplastovú DNA, ktorá je špecifická pre rastlinne bunky a tym bolo možné potvrdiť rastlinnú DNA vo vzorke.

Primery pre rastlinnú DNA tvorili produkty o dĺžke približne 120–150 bp. Primerový pár bol navrhntý v súlade s Harrisonom et al. (2007). Sekvencia pre rastlinnu DNA bola:

Forward, 5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTACG- 3’,

Reverse , 5’-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC- 3’.

Hlavnou zložkou pri Go Taq® qPCR Master Mix v objeme bolo 12,5 µl Go Taq qPCR mix, ktorý bol doplnený o 10,5 µl superčistej vody, 0,5 µl z každého primeru a 1 µl DNA aby bol dosiahnutý celkový objem 25 µl.

Finálne preldžovanie fragmetov prebiehalo pri teplote 72 °C po dobu 5 minút. Krivka topenia PCR produktov bola spustená zahriatím vzorky na 95 °C a okamžitým schladením na 65 °C po dobu 15 sekúnd. Vzorka bola zohrievaná rýchlosťou 0,1 °C za sekundu a pri každej zmene teploty o desatinu stupňa bola zmeraná fluorescencia. PCR reakcia prebiehala v kapilárovom cykléri LightCycler® 1,5 (Roche) a výsledký boli zaznamenané za pomoci softvéru LightCycler software version 4.05 (Roche).

25. 
    Kŕmenie
    

Kurčatá boli kŕmené ad libitum kŕmnymi zmesami HYD-01-KZ (štartér) vo veku 1 až 18 dní, HYD-02-KZ (rastová) vo veku 19 až 31 dní a HYD-03-KZ (finálna)

26. 
    Metódy štatistického spracovania výsledkov
    

Prvotné údaje sme vyhodnotili podľa základnej štatistickej charakteristiky (x = aritmetický priemer, s = smerodajná odchýlka, v_k = variačný koeficient). Rozdiely hodnôt ukazovateľov medzi skupinami sme vyhodnotili na základe F- testu a Scheffeho testu (hladina významnosti P_0,05) (ANOVA) v programovom systéme SAS, verzia 8.2. Výsledky sme spracovali formou tabuliek a grafov.

27. 
    Výsledky práce
    

28. 
    Účinnosť pamajoránovej silice
    

Obsah karvakrolu a antioxidačná aktivita pamajoránovej silice sú uvedené v tabuľke č. 10 a 11.

Tab. 10

Obsah karvakrolu v pamajoránovej silici

Obsah biologicky účinnej látky karvakrolu v pamajoránovej silici, ktorú sme použili do kŕmnych zmesí v prvom experimente bol 57,00 %, v druhom experimente 57,00 % a v treťom experimente 56,00 %.

Tab. 11

Antioxidačná aktivita pamajoránovej silice


	Experiment
	1.	2.	3.
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (% inhibície)	93,89 ±0,10	93,89 ±0,10	93,89 ±0,10




Celková antioxidačná aktivita pamajoránovej silice použitej v kŕmnych zmesiach prvého experimentu bola 93,89 ± 0,10 %, druhého experimentu 93,89 ± 0,10 % a v treťom experimente 93,89 ± 0,10 %. Pamajaoránová silica preukázala vysokú schopnosť inhibície.

29. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a zmesi pamajoránovej silice s probiotikom na počet mikroorganizmov v chýmuse slepých čriev brojlerových kurčiat
    

30. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a pamajoránovej silice s probiotikom na počet mikroorganizmov v chýmuse slepých čriev brojlerových kurčiat 1. experimentu
    

		Lactobacillus sp.	Enterococcus sp.	Koliformné bakterie
Skupina		x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)
Silica	1. PS	5,48	5,67	6,08
		6,95	5,87	6,56
		6,74	5,02	6,41
Probiotikum	2. PS	5,81	5,79	6,92
		6,56	5,63	6,82
		6,78	5,85	7,06
Silica + Probiotikum	3. PS	5,78	5,49	7,12
		6,07	5,13	6,78
		5,96	5,64	6,91
Kontrolná skupina	KS	6,88	5,71	7,43
		6,58	6,03	7,84
		6,64	5,71	6,96

V tabuľke 12 sú zaznamenané priemerné hodnoty počtu sledovaných mikroorganizmov jednotlivých riedenií zo všetkých misiek, ktoré sme následne spriemerovali a graficky znázornili v grafoch.

31. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a pamajoránovej silice s probiotikom na počet mikroorganizmov v chýmuse slepých čriev brojlerových kurčiat 2. experimentu
    

		Lactobacillus sp.	Enterococcus sp.	Koliformné bakterie
Skupina		x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)
Silica	1. PS	8,36	6,74	6,93
		7,11	7,48	7,26
		7,45	6,62	7,59
Probiotikum	2. PS	8,75	6,59	8,18
		8,48	6,59	7,45
		8,55	6,52	7,81
Silica + Probiotikum	3. PS	8,71	7,48	7,72
		8,52	6,54	7,84
		8,05	6,54	7,3
Kontrolná skupina	KS	8,16	6,81	7,86
		8,38	7,07	8,13
		7,14	7,58	7,78

Priemerný počet Lactobacillus sp. bol pri silici 7,64 log KTJ.g^-1, pri probiotiku sa zvýšil na 8,59 log KTJ.g^-1 a táto stúpajúca tendencia pokračovala aj pri silici + probiotikum (8,43 log KTJ.g^-1). V kontrolnej skupine sme zaznamenali priemerný počet Lactobacillus sp. 7,89 log KTJ.g^-1.

32. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a pamajoránovej silice s probiotikom na počet mikroorganizmov v chýmuse slepých čriev brojlerových kurčiat 3. experimentu
    

		Lactobacillus sp.	Enterococcus sp.	Koliformné bakterie
Skupina		x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)	x (log KTJ.g-1)
Silica	1. PS	7,54	7,19	7,41
		8,09	7,47	7,62
		8,04	7,35	7,51
Probiotikum	2. PS	7,89	7,45	7,54
		7,94	7,12	6,5
		7,93	7,59	6,89
Silica + Probiotikum	3. PS	8,06	7,78	7,06
		7,74	7,79	7,45
		7,41	7,44	6,37
Kontrolná skupina	KS	7,72	7,55	7,33
		6,61	7,22	7,75
		7,79	7,45	7,31

Priemerný počet Lactobacillus sp. bol pri silici 7,89 logKTJ.g^-1,pri probiotiku sa zvýšil na 7,92 log KTJ.g^-1 a pri silici + probiotikum sa znížil na 7,74 log KTJ.g^-1. V kontrolnej skupine sme zaznamenali priemerný počet Lactobacillus sp. 7,37 log KTJ.g^-1. Priemerný počet Enterococcus sp. bol pri silici 7,34 log KTJ.g^-1, pri probiotiku sa zvýšil na 7,39 log KTJ.g^-1 a pri silici + probiotikum sa zvýšil na najvyššiu hodnotu

33. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a pamajoránovej silice
    s probiotikom na mikroskopické vláknité huby v kŕmnych zmesiach pre brojlerové kurčatá
    

Priemerný počet mikroskopických vláknitých húb sme získali na základe ich sledovania na dvoch odlišných živných pôdach. Na základe počtu mikroskopických vláknitých húb sme vypočítali ich relatívny podiel, t.j. celkový počet nájdených izolátov ako aj percentuálne zastúpenie jednotlivých druhov a rodov.

34. 
    Vplyv pamajoránovej silice, probiotika a pamajoránovej silice
    s probiotikom na mikroskopické vláknité huby v kŕmnej zmesi HYD-01