Slovenská poľnohospodárska univerzita nitra fakulta biotechnológie a potravinárstva

Definícia probiotík naznačuje, že baktérie by mali byť životaschopné v čase požitia aj po prechode cez tráviaci trakt. To je dosiahnuté schopnosťou určitých probiotických druhov tolerovať vysoko kyslé prostredie v žalúdku a koncentráciu tráviacich štiav nachádzajúcich sa v tenkom čreve. Mnohé in vitro štúdie vrátane štúdie zameranej na toleranciu nevýhodných podmienok v tráviacom trakte a adhéziu k epitelovým bunkám hostiteľa boli použité na demonštráciu prežitia probiotických druhov mikroorganimov v tráviacom trakte (Fernandez et al., 2003).

Po orálnom podaní probiotík bolo jedným z očakávaných výsledkov prežitie probiotickej kultúry vo fekáliách, pričom bola vyrovnaná nestabilita v tráviacom trakte (Alander et al., 1999; Cesana, 2001).

Nebolo dokázané, či upravenie mikrobiologickej rovnováhy v horných častiach tráviaceho traktu by malo byť vyjadrené zvýšeným množstvom mikroorganizmov v hrubom čreve a exkrementoch. V experimentoch so zvieratami bolo preukázaných niekoľko vzťahov medzi mukálnou mikroflórou horných častí gastrointestinálneho traktu a mikroflórou vo fekáliách (Mikelsaar et al., 1998).

Pereira a Gibson (2002) sledovali toleranciu Lactobacillus fermentum izolovaného z tráviaceho traktu človeka na stupeň kyslosti a žlče a preukázali jeho schopnosť prežiť po dobu 2 hodín pri pH 2 a schopnosť rásť v médiu so 4,0 mg žlčových kyselín na liter. Bola zistená tolerancia Lactobacillus fermentum na znížené hladiny pH v rozmedzí 4,0–2,5 bez straty množstva živých buniek (Songisepp, 2005).

Široké spektrum metabolitov je zodpovedné za potlačenie rastu patogénnych mikroorganizmov in vitro u zvierat. Veľa metabolitov produkovaných baktériami mliečneho kvasenia má široké spektrum antimikrobiálnych aktivít voči iným druhom, najmä G^- baktériám (Songisepp, 2004).

Veľký význam sa pripisuje najmä baktériam mliečneho kvasenia ako sú: laktobacily, streptokoky, bifidobaktérie a enterokoky, ktoré majú schopnosť skvasovať mliečny cukor (laktózu) a iné cukry na krátko reťazcové karboxylové kyseliny (mliečnu, octovú, propiónovú, maslovú), tým znižujú pH prostredia. Ďalej produkujú vitamín K a iné vitamíny potrebné pre hostiteľa. Sú schopné dehydroxylovať a dekonjugovať žlčové kyseliny. Tým bránia ich premene na fekálne sekundárne žlčové kyseliny, ktoré sa zúčastňujú na patogenéze vzniku rakoviny hrubého čreva. Sú schopné premieňať bilirubín na urobilinogén a cholesterol na koprostanol, čím znižujú množstvo jeho resorpcie z gastrointestinálneho traktu (Lugea et al., 2000; Banan et al., 2000).

Baktérie mliečneho kvasenia vytvárajú v čreve mikroprostredie, ktoré bráni nielen premnoženiu patogénov, ale aj rôznych hnilobných a iných menej prospešných baktérií obsadením adhéznych receptorov. Na epitelových bunkách znemožňujú prichytenie patogénnych mikroorganizmov na povrchu sliznice a ich penetráciu

Využívajú živiny, ktoré by inak boli dostupné a vhodné pre patogény a produkujú metabolity a bakteriocíny (napr. nizín, bulgaricín, reuterín rodom Lactobacillus), ktoré inhibujú rast patogénov (Freitas et al., 2001; 2002).

Taktiež bola zistená jeho mierna antimikrobiálna aktivita voči Helicobacter pylori (Hutt et al., 2006).

Hypotéza kompetície o živiny v črevnom lumene medzi osídlenými a invadujúcimi baktériami bola odvodená od pozorovania, že tieto baktérie kontinuálne spolu kultivované súťažia o živiny. Baktérie mliečneho kvasenia, ktoré rastú na mieste kolonizácie, môžu využívať živiny, ktoré by inak boli dostupné pre patogény, alebo môžu produkovať metabolity, ktoré inhibujú rast patogénov (Perdigon et al., 2001).

Účinné probiotikum by sa malo vyznačovať tým, že ako vyrobený, životaschopný produkt v priemyselnom meradle, môže ostať stabilné a životaschopné počas dlhej doby v praktických podmienkach uskladnenia, bude schopné prežívať (nie nevyhnutne rásť) v črevách a mať prospešné účinky na hostiteľa.

Existujú tri rozličné spôsoby účinku probiotík: 1. priama interakcia s črevnou mikroflórou zahŕňajúca patogény založená na mechanizme kolonizačnej rezistencie;
2. obohatenie funkcie črevnej bariéry ovplyvnením kvality tenkých spojení;
3. moduláciou množstva mukálnych imunitných buniek a aktivitou imunitného systému. Takýmito spôsobmi probiotiká upravujú zloženie črevnej mikroflóry a modulujú imunitný systém hostiteľa. Nedávne štúdie odhalili, že prevencia kolonizácie patogénnych mikroorganizmov v gastrointestinálnom trakte je základným mechanizmom pozitívneho účinku probiotík (Reid et al., 2006; Ljungh a Wadstrom, 2006).

Mechanizmus účinku pozitívneho vplyvu probiotík zahŕňa súťaženie o miesto ako aj živiny a imunomoduláciu (Rolfe, 2000).

Probiotiká dokážu zlepšiť absorpciu minerálnych látok, syntézu a absorbciu vitamínov, hlavne vitamínov skupiny B, ktoré sú dôležité pre normálne fungovanie nervového systému a pozitívne pôsobia proti stresu. Použitie probiotík malo za následok značné zmeny α-galaktozidázy a ß-galaktozidázy, ktoré hrajú dôležitú úlohu vo fermentačných procesoch nestrávených sacharidov. Navyše probiotiká potláčajú baktérie produkujúce ureázu čím zlepšujú štruktúru čriev (Samanya a Yamauchi, 2002).

Laktobacily upravujú štruktúru čriev, mikrobiálnu fermentáciu, čím cielene zlepšujú celkový zdravotný stav kurčiat (Meimandipour et al., 2010).

Medzi najčastejšie testované vlastnosti potencionálne probiotických kultúr patrí:

- testy rezistencie na žlč,

- testy rezistencie proti kyselinám,

- meranie rastovej rýchlosti,

- testy adhézie na črevný epitel,

- testovanie antagonistických vlastností proti patogénom,

- testovanie produkcie biologicky aktívnych látok (baktériocíny, enzýmy a pod.),

(Filho-Lima, 2000; Gill a Rutherfurd, 2001).

Ďalším z predpokladaných mechanizmov zodpovedný za pozitívny efekt probiotík je modulácia imunity (Higgins et al., 2007b).

Probiotiká zlepšujú imunitnú spôsobilosť brojlerových kurčiat aktiváciou makrofágov a zvýšením produkcie systémových a miestnych antigénov (Ahmad, 2006).

Niektoré štúdie naznačuje, že nárast celkového počtu leukocytov v skupinách kŕmených probiotikami a prebiotikami je indikovaný stimuláciou mikroorganizmov v tráviacom trakte leukopoetickým účinkom (Nyamagonda et al., 2009).
Rod Enterococcus

Ako uvádza Becquet (2003), medzi populárne mikroorganizmy využívané ako probiotiká patria kmene enterokokov. Enterokoky majú pozitívny efekt na črevnú mikroflóru hlavne mladých zvierat alebo počas ich rastu a dospievania (Maia et al., 2001).

Z tráviaceho traktu hydiny boli vyizolované nasledujúce druhy rodu Enterococcus: E. avium (Desai et al., 2001), E. cecorum (Debnan et al., 2005), E. durans (Rinkinen et al., 2000), E. faecalis, E. faecium (Du Toit el al., 2000; Jin et al., 2000), E. gallinarum a E. malodoratus (Debnan et al., 2005), E. hirae (Stromfová et al, 2004).

Najčastejšie sa vyskytujúcim druhom je jednoznačne E. faecalis, nasledovaný E. faecium (Lauková et al., 2002, 2003). Rovnaké druhy prevažovali aj

Enterokoky sú často používané ako účinná zložka mnohých probiotík. Ich hlavnou výhodou je veľká odolnosť proti vnútorným vplyvom (v porovnaní

Bakteriálne kmene považované za bezpečné a široko využívané ako probiotiká sú bifidobaktérie a laktobacily. Tieto mikroorganizmy osídľujú intestinálny trakt zvierat ale aj ľudí (Holzapfel et al., 2001; Ishibashi a Yamazaki, 2001; Siezen et al., 2004).

Rod Bifidobacterium zahrňuje grampozitívne, nesporulujúce, pleomorfné, striktne anaeróbne tyčinky (Bibiloni, 2001, He et al., 2001).

Typickým morfologickým znakom tohto rodu je tendencia buniek k vetveniu. V čistých kultúrach možno hlavne na polotuhých živných prostrediach pozorovať tvary podobné písmenám Y, X a V. Rod Bifidobacterium v súčasnej dobe spolu zahrňuje 33 druhov (Rada a Petr, 2000).

Mnoho typov bifidobaktérií bolo izolovaných z výkalov (alebo z tráviaceho traktu) zvierat (králik, kurča, teľa, myš, včela a ciciaky). Niektoré z týchto bifidobaktérií sa zdajú byť špecifické pre určitého hostiteľa. Napríklad B. magnum, B. pullorum a B. gallinarum sa vyskytujú v tráviacom trakte kurčiat. U sliepky domácej bolo doposiaľ izolovaných a popísaných 6 druhov Bifidobacterium sp. (Hadadji et al., 2004)

Rod Lactobacillus

Rod Lactobacillus sú tyčinky variabilnej veľkosti od dlhých až po kokobacily. Obvykle nepohyblivé, gram-pozitívne, s rastúcim vekom a kyslosťou prostredia prechádzajú na gram-negatívne. Metabolizmus majú fermentatívny i keď rastú v prítomnosti kyslíka, niektoré sú striktne anaeróbne. Sú sacharolytické, fermentujú glukózu, pričom sa pH znižuje o jednu, či viac jednotiek. Najmenej polovica uhlikatých metabolitov je laktát, ktorý sa nefermentuje. Vedľajšie produkty môžu byť acetát, formiát, sukcinát, oxid uhličitý alebo etanol. Prchavé mastné kyseliny s viac ako dvomi atómami uhlíka nie sú produkované (Reid et al., 2003b).

Laktobacily a bifidobaktérie sú historicky považované za bezpečné v spojení s potravinami. Sú to baktérie osídľujúce tráviaci trakt a ich patogénny potenciál je veľmi nízky. Na druhej strane niektoré rody laktobacilov sú spájané so systémovými a lokálnymi infekciami (Salminen et al., 2006).

Laboratórne testy s laktobacilom potvrdili bezpečnosť tejto baktérie. Najdôležitejším hľadiskom na posúdenie bezpečnosti baktérií je štúdia zameraná
na prítomnosť plazmidov, ktoré zabezpečujú prenos rezistencie voči antibiotikám a prirodzenej rezistencii na sulfametaxozol, metronidazol a cefoxytín, čo sa zhoduje s kmeňmi L. fermentum používanými v potravinárstve (Vankerckhoven et al., 2008).

Bezpečnosť L. fermentum bola testovaná opakovane na myšiach, ktorým bolo toto probiotikum podávané do vody a taktiež do syra počas niekoľkých mesiacov, bez akýchkoľvek negatívnych účinkov (Songisepp et al., 2004).

Ďalší experiment zameraný na vplyv tohto probitika na tyfoidnú horúčku bol vyhodnocovaný na myšiach nakazených Salmonella typhimurium (Truusalu et al., 2004). Pri tomto experimente L. fermentum nedokázalo eliminovať salmonely z organizmu, ale potláčalo niektoré reakcie spôsobujúce infekčné vplyvy a horúčky.

Zlepšená peroxidácia tukov a abnormálny pomer glutatiónového redoxu boli upravené a tak sa zlepšila antioxidačná rovnováha črevnej mukózy (Truusalu et al., 2004).

Laktobacily sú najčastejšie používanými produkčnými mikroorganizmami
pre prípravu probiotík. Tvoria typickú súčasť mikroflóry črevného traktu cicavcov a vtákov, kde plnia významnú úlohu pri zisťovaní prirodzeného obranného systému a pozitívne ovplyvňujú proces celkového metabolizmu (Tannock, 2004).

Pridaný Lactobacillus fermentum ako probiotická zložka do mliečnych produktov (jogurt, syr, mlieko) bol schopný potlačiť kontaminanty potravín ako sú patogénne druhy Salmonella sp., Shighella sp. ako aj pôvodcov infekcie močového traktu Escherichia coli, Staphylococcus sp. Hlavnými antimikrobiálnymi účinkami bola tvorba peroxidu vodíka a dusíka laktobacilom (Kullisaar et al., 2002).

Metóda na simultánne potlačenie patogénov a zlepšenie antioxidačnej aktivity potravín bola už patentovaná v USA (Mikelsaar et al., 2007). Experimenty in vivo potvrdili, že nárast celkového množstva laktobacilov potlačil rast salmonel a predchádzali formácii infekcií Salmonella typhimurium. Po prvý raz bolo dokázané, že antibiotiká v spojitosti s probiotikami pomohli v terapii proti invázivnému ochoreniu enteritíde. Aj keď nemôže byť vylúčené, že mimo antimikrobiálneho efektu laktobacilov zohrali veľkú úlohu antibiotiká (Truusalu et al., 2008).

Nedávno získané údaje dokazujú, že podanie Lactobacillus fermentum zvyšuje úroven triacylglycerolov v krvi a zmierňuje zvyšovanie nežiadúceho cholesterolu (Kullisaar et al., 2006; 2008).

Účinok Lactobacillus sp. bol dokázaný potlačením patogénneho kmeňa Salmonella typhimurium. Pri použití v enkapsulovanej forme, alebo pridaním
do potravín (jogurty, kefír, syr) sa Lactobacillus sp. vyznačoval mnohými zdraviu prospešnými vlastnosťami a to nielen v štúdiach zameraných na zvieratá ale aj ľudí (Mikelsaar and Zilmer, 2009).

4. 
   Použitie silíc ako náhrady kŕmnych antibiotík
   

V nadväznosti na výskumné bádanie 6. rámcového projektu Európskeho spoločenstva Food Quality and Safety Priority, Tedesco a Galletti (2004) konštatujú, že rastlinné kŕmne doplnky, ako sú silice a rastlinné zmesi, sa vyznačujú biologickou bezpečnosťou a účinnosťou. Štandardy zdravotnej neškodnosti pre tento druh kŕmnych doplnkov, rovnako aj potravinových ingredientov boli stanovené ako biologicky bezpečné látky. Doteraz nie je legálne deklarované, či tieto druhy rastlinných doplnkov sú kŕmnymi aditívami alebo liečivami.

Vo Švédsku už pred 25 rokmi (1986) bolo zakázané používanie kŕmnych antibiotík. Vzhľadom na zvýšený výskyt chorôb tráviacej sústavy (hnačky), nižšie prírastky telesnej hmotnosti ale aj úhyn mláďat po narodení sa zvýšilo používanie antibiotík ako liečiv. V overovaných experimentoch s brojlerovými kurčatami bol zaznamenaný zvýšený úhyn 9,6 % spôsobený nekrotickou enteritídou u skupiny bez antibiotika v porovnaní s 2,4 % v skupine s antibiotikom. Významným poznatkom týchto pokusov bolo, že používaním antibiotík a antikokcidiostatík sa štatisticky preukazne (P<0,05) zvýšili prírastky telesnej hmotnosti a zlepšila sa konverzia krmiva. Pri zhodnotení celkovej spotreby antibiotík a chemoterapeutík bolo zistené, že aj po zákaze kŕmnych antibiotík táto zostala nezmenená. Celkovým výsledkom zákazu bolo zvýšenie cien a zníženie všetkých ukazovateľov produktivity, ktoré pretrváva dodnes (Viaene, 1997).

Liečivé rastliny a silice extrahované z týchto rastlín boli používané ako alternatíva k antibiotikám. Z týchto dôvodov sa tieto liečivé rastliny stávajú čoraz dôležitejšie z hľadiska ich antimikrobiálneho vplyvu a stimulačného efektu na tráviaci trakt zvierat (Osman et al., 2005).

Použitím prídavku rastlinných silíc u broilerových kurčiat nakazených kokcidiózou bola docielená pozitívna modulácia traviaceho traktu v porovnaní s brojlermi kŕmneými premixmi bez obsahu silíc. (Oviedo-Rendón et al., 2006)

Rastlinné kŕmne doplnky zo skupiny bylín sa vyznačujú protizápalovými a bakteriostatickými účinkami. Rovnako efektívne pôsobia ako antimikrobiálne látky v tráviacej sústave a upokojujúce látky. Zlepšujú chutnosť krmív, stráviteľnosť živín

Súčasné informácie naznačujú, že pridaním silíc sa zlepšujú prírastky telesnej hmotnosti brojlerových kurčiat a stráviteľnosť dusíka vďaka modulácii mikroflóry v tráviacom trakte brojlerových kurčiat (Amerah et al., 2011).

K zaujímavým výsledkom dospeli aj Kinal et al. (1997). V experimentoch s brojlerovými kurčatami použili do ich kŕmnych zmesí sušený mletý myší chvost obyčajný, cesnak, medovku lekársku a nechtík lekársky. Najvyšší prírastok telesnej hmotnosti bol zaznamenaný u brojlerových kurčiat kŕmených kŕmnou zmesou s obsahom 1 % myšieho chvosta obyčajného. Ale výsledky jatočného rozboru tela boli nižšie v tejto skupine kurčiat spolu s kurčatami, ktoré skrmovali nechtík lekársky. Napriek nižším hodnotám jatočnej hodnoty kurčiat senzorické vlastnosti ich prsnej svaloviny dosiahli vyššie hodnoty. Všeobecne senzorické vlastnosti mäsa zodpovedali požadovaným kritériám.

Podobné výsledky boli zaznamenané aj dalšími autormi, pričom bol pozorovný pozitívny účinok silice tymolu a kondenzovaného tanínu ako aj ďalších liečivých rastlín. Rastlinné výťažky však značne ovplivňovali chuť mäsa (Cross et al., 2011). Tieto výsledky však možu byt ovplyvnené pridaním vyššieho množstva rastlinných silíc do krmných zmesí.

V ostatných rokoch sa zvýšil záujem o využívanie rastlinných silíc a extraktov  ako antimikrobiálnych látok vo výžive zvierat. Z tohto dôvodu je málo publikovaných vedeckých prác z tejto oblasti. Známe sú metódy ich získavania, obsahu biologicky účinných látok a ich účinky (Aprotosoaie et al., 2004).

Výsledky, ktoré dosiahli Svoboda a Brooker (2004) vo svojich experimentoch potvrdzujú, že rastlinné silice a  extrakty sa vyznačujú antimikrobiálnymi účinkami a účinkami proti mikroskopickým hubám (proti klostridiálnym infekciám u hydiny). Títo autori sú názoru, že rastlinné silice majú perspektívu využitia v priemyslovej výrobe, v chove zvierat a ochrane zdravia človeka. Presný mechanizmus ich účinkov nie je zatiaľ známy. In vitro screening metódou títo autori hodnotili vplyv rastlinných sekundárnych metabolitov na anaeróbne mikrobiálne účinky vzoriek gastrointestinálnej sústavy hydiny a známe patogény. Ich výsledky demonštrujú výber niektorých rastlinných metabolitov proti črevným patogénom a naznačili potenciál náhrady za kŕmne antibiotiká.

Štúdie potvrdili, že silice v krmných dávkach ovplyvňujú množstvo a zloženie baktérií tráviaceho traktu znížením množstva propionátu a zvýšením množstva acetátu a butyrátu v tráviacom trakte. Dôvodom zníženia množstva propionátu a zvýšenia acetátu môže byť výskyt baktérií Lactobacillus a Bifidobacterium, nakoľko pomáhajú transformovať kyselinu mliečnu na kyselinu maslovú (Duncan et al., 2004).

Bol dokázaný prospešný účinok enkapsulovaných silíc tymolu a cynamaldehydu na tráviaci trakt, v dôsledku čoho bola znížená mortalita broilerových kurčiat v prvých troch týždňoch výkrmu a zlepšený zdravotný stav. Je nutné poznamenať, že v budúcnosti by sa štúdie mali zamerať na vplyv antimikrobiálnych silíc na mikrobiálnu populáciu tráviaceho traktu v rôznych podmienkach prostredia (Cao et al., 2010).

Z aktuálnych literárnych poznatkov vyplýva, že sú známe metódy získavania rastlinných silíc, ich chemické zloženie, účinná látka a antimikrobiálne účinky (Habán et al., 2004; Apetrei et al., 2004; Aprotosoaie et al., 2004; Růžičková, 2004; Slavkovska et al., 2004 ).

V skupinových kŕmnych experimentoch s výkrmovým typom kurčiat Cobb 500 overovali efektívnosť premixu pamajoránovej silice Angelovičová et al. (2005a) ako náhrady za kŕmne antibiotikum avilamycín. Ich výsledky potvrdili porovnateľnú produkčnú účinnosť kŕmnych zmesí s premixom silice a kŕmnych zmesí s kŕmnym antibiotikom.

Vplyv tymiánu a škorice na rast kurčiat študoval Al-Kassie, (2009), pričom zistil pozitívny vplyv na zlepšenie celkového zdravotného stavu broilerových kurčiat (Al-Kassie, 2009). Súčasné štúdie naznačujú, že kŕmenie krmivom obohateným o rastlinné silice malo pozitívny vplyv na hladinu cholesterolu v porovnaní s kontrolnou skupinou kŕmenou bez prídavku silíc. Tieto zistenia boli potvrdené aj ďalšími autormi (Kannan et al., 2005; Gudev et al., 2008; Paryad a Mohmoudi, 2008).

Rastlinné silice a extrakty  sa získavajú zo skupiny špeciálnych úžitkových rastlín, ktoré sú označené ako liečivé, aromatické a koreninové rastliny. Ich pestovanie je cielené za účelom získavania určitých špecificky účinných látok. Môžu sa používať v preventívnej liečebnej výžive (Habán a Šalamoun, 2002).

5. 
   Antimikrobiálny účinok silíc
   

Karvakrol je jednou z hlavných zložiek silicových frakcií oregana (60–74% karvakrol) a tymiánu (45% karvakrolu) (Lagouri et al., 1993; Arrebola et al., 1994). Svojimi hydrofóbnymi vlastnosťami ovplyvňuje biologické membrány buniek baktérií (Ultee et al., 1999).

Karvakrol a nizín preukazne inhibujú rast Bacillus cereus, Bacillus circulans, aj keď do istej miery bol Bacillus circulans citlivejší na vplyv týchto silíc (Periago a Moezelaar, 2001).

Rast rodu Bacillus môže byť inhibovaný použitím prírodných antimikrobiálnych látok ako karvakrol a nizín, aj keď ich účinok je druhovo špecifický (Rajkovic et al., 2005).

Karvakrol, tymol, cynamaldehyd a eucalyptol rastlinných silíc majú pozitívny účinok na potlačenie baktérií rodu Clostridium (Jujena a Friedman, 2007).

Tieto silice môžu byť použité na kontrolu nekrotickej enteritídy u broilerových kurčiat (Timbermont et al., 2010).

Antimikrobiálny efekt silíc je v centre pozornosti viacerých vedcov a v súčasnosti existuje veľa poznatkov o tejto téme. Silice oregana podporujú inhibíciu Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium a Listeria monocytogenes (Oussalah et al., 2007).

Podobná vlastnosť bola dokázana aj v cesnakovom oleji, nakoľko inhibuje Escherichia coli, Salmonella typhimurium a niektoré druhy enterobaktérií (Dieumou et al., 2009).

Výsledky experimentu zameraného na vplyv tymolu a cinnamaldehydu z rastlinných silíc na rast brojlerových kurčiat a ich črevnú mikroflóru naznačujú pozitívny vplyv na črevnú mikroflóru brojlerových kurčiat vďaka prídavku silíc a ich antimikrobiálnej aktivite. Prídavok silíc zvýšil prírastok telesnej hmotnostii u kurčiat o 4,5 % (Tiihonen et al., 2010).

Časť aktívnych zložiek rastlinných silíc bola už identifikovaná a medzi najdôležitejšie patria eugenol, cinnamaldehyd a karvakrol. Tieto zložky vykázali účinok proti mnohým rodom G⁺ a G^- baktérií. Eugenol je aktívny proti Escherichia coli O157:HT a Listeria monocytogenes (Blaszyk a Holley, 1998).

Aktivita cinamaldehydu bola zaznamenaná proti Clostridium botulinum (Bowles a Miller, 1993), Staphylococcus aureus (Bowles et al., 1995), Escherichia coli O157:H7

a Salmonella Typhimurium (Helander et al., 1998).

Karvakrol je aktívny proti Bacillus cereus (Ultee et al., 1998), Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium a Escherichia coli O157:H7 (Kim et al., 1995; Cosentino et al., 1999).

Silica Melaleuca alternifolia sa stáva čoraz častejšie používaná ako prírodne sa vyskytujúci antimokrobiálny prvok. Bolo zistené že je aktívna voči širokému spektru mikroorganizmov (Carson a Railey, 1995).

Hrozno má vysoký obsah fenolických zlúčnín, ktoré dokážu upraviť aktivitu čriev ako aj štruktúru a funkciu tráviaceho traktu. Mikrobiálna aktivta avoparcínu, ktorý obsahuje hrozno bola vyhodnocovaná z hľadiska možnosti modulácie tráviaceho traktu. Bolo zistené, že u zvierat kŕmených krmivom s prídavkom avoparcínu boli zaznamenané zvýšené počty Lactobacillus sp. v porovnaní s kontronlu skupinou. Takisto bol dokázaný zvýšený počet rodu Enterococcus sp. a znížené počty rodu Clostridií v črevách (Viveros et al., 2011).

Bola skúmaná aktivita 93 komerčne dostupných silíc na 20 sérotypov Listeria monocytogenes v in vitro podmienkach. V tomto výskume bolo zaznamenané, že vysoký efekt proti Listeria monocytogenes mali práve silice obsahujúce vysoké percento monoterpénov, eugenolu, tymolu a karvakrolu (Lambert et al., 2001).

Potvrdená bola aj aktivita silíc Melaleuca alternifolia proti mnohým rodom G⁺ a G^- baktérii a špecificky proti Candida Albicans (Hammer, Carson, Railey, 1999).

Bol skúmaný efekt 21 rastlinných silíc medzi nimi aj silice Origanum vulgare na 5 významných patogénov kontaminujúcich potraviny (Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus a Listeria monocytogenes). Všeobecne boli G⁺ baktérie citlivejšie na účinok silíc ako G^- baktérie. Campylobacter jejuni bol medzi skúmanými mikroorganizmami najrezistnejší s antimikrobiálnym účinkom len vavrínu a tymianu (Palmer, 1998).

Tri silice z rodu  Origanum (Origanum vulgare, Origanum hirtum a Origanum dictamnus) boli analyzované plynovou chromatografiou a ukázali vysoký obsah karvakrolu, γ-terpinénu, p-cyménu. U všetkých analyzovaných silíc bol zaznamenaný vysoký antimikrobiálny efekt proti mnohým rodom G⁺ a G^- baktérii. Silice Origanum spp. hitrum sa ukázali extrémne baktéricidné pri zriedení 1/400 a dokonca pri zriedení 1/50000 spôsobavali zníženie bakteriálneho rastu. Táto silica dokonca vykázala vysoký stupeň cytotoxicity proti bunkám 2 línii ľudskej rakoviny (Sivropoulou, 1996).

Karvakrol a tymol rastlinných silíc boli testované pre ich inhibičnú aktivitu

Použitie α-tokoferolu malo značný vplyv na rast brojlerových kurčiat a ako aj vplyv na imunitné odpovede u brojlerových kurčiat. Bolo zostené, že α-tokoferol má pozitívny vplyv na imunitné odpovede organizmu brojlerových kurčiat. Takisto boli zaznamenané zvýšené hladiny celkových proteínov, globulínu, trygliceridov a cholesterolu v krvnom sére (Rama Rao et al., 2011).

Je dlhodobo známe, že tymol, cynamaldehyd a eucalyptol majú potvrdenú antimikrobialnu aktivitu voči Clostridium perfringens (Jujena a Friedman, 2007). V súvislosti s týmito silicami bolo taktiež dokázané, že niektoré znižujú kolonizáciu a proliferáciu Clostridium perfringens (Mitsch et al., 2004).

Čo je však najdôležitejšie je ich vplyv na redukciu kokcdiózy a tým aj

Silice rastlín kamilky a majoránu preukázali protirakovinový a antioxidačný účinok (Romeliah, 2009).

Antimikrobiálny efekt silíc majoránu bol dokázaný vo viacerých štúdiách (Sonboli et al., 2005).

Vincent et al. (2007) zistili, že kapsaicín extrahovaný z papriky mal profylaktický účinok na infekcie spôsobené Salmonellou enteritidis.

Podobný efekt zaznamenali Valero a Salmeron (2003) aj u silíc mäty, škorice a tymiánu, ktoré naviac pôsobili aj proti Bacilus cereus.

Silice oregana a cesnaku spolu alebo v kombinácii redukujú počty Clostridium sp. v tenkom čreve a mohli by byť komerčne zaujímavé. Synergický efekt by mohol byť skúmaný na dosiahnutie maximálnej antimikrobiálnej aktivity týchto silíc za použitia minimálneho množstva a dosiahnutia želaného antibakteriálneho efektu (Kirkpinar at al., 2011).

Rastliny obsahujú širokú škálu fytochemických zložiek s antimikrobiálnou aktivitou, ktoré môžu mať pozitívny alebo podporný vplyv na zvieratá (Panter et al., 2004; Acamovic a Brooker, 2005) v závislosti od zložky ako aj jej koncentrácie. Je možné, že terpén a fenolické zložky silíc spolu s ďalšími zložkami zabraňujú utilizácii nutrientov u vtákov (Oduguwa et al., 2007).

Liečivé rastliny a silice z nich získané môžu ovplyvniť rast ako aj endogénnu sekréciu u brojlerových kurčiat (Cross et al., 2007).

Doteraz je známych iba málo informácií o presnej dávke silíc z hľadiska jej efektivity. Je možné, že príliš vysoké množstvá silíc majú negatívny vplyv na črevnú mikroflóru (Acamovic a Brooker, 2005).

6. 
   Použitie silíc ako ochrannej látky voči rastlinným patogénnym baktériám a mikroskopickým vláknitým hubám
   

Je zložité a pracné kontrolovať bakteriálne ochorenia rastlín kvôli nedostatku účinných chemikálií. Jedným z možných riešení by bolo použitie antibiotika streptomycín (predávaný ako agromycín 17). Jeho nevýhodou je cenová náročnosť a taktiež skutočnosť, že mnohé látky, ktoré sú používané v humánnej medicíne, nie sú povolené v poľnohospodárstve. Táto obava núti mnohých vedcov hľadať alternatívne riešenia. Následkom toho sa zvyšuje záujem vedcov o prírodné látky, o ich bezpečnosť a možné použitie v tejto oblasti.

Jednou z týchto látok sú aj silice, nakoľko sú bezpečné pre životné prostredie a dokážu vplývať na vývoj chorôb (Isman, 2000).

Silice sú sekundárne metabolity produkované určitými druhmi rastlín

Aj keď sa rastlinné silice a aj ich zložky využívali často v humánnej medicíne (Filoche et al., 2005), farmaceutickom priemysle a potravinárstve (Burt, 2004; Valero a Giner, 2006) kvôli ich antimikrobiálnej aktivite, len málo pozornosti sa venovalo ich použitiu proti patogénnym baktériám.

Bol dokázaný ich vplyv voči Erwinia sp. (Abo El-Seoud et al., 2005).

Výsledky výskumu poukazujú na to, že silice škorice, rozmarínu a tymiánu vykazujú antibakteriálnu aktivitu voči Agrobacterium tumefaciens a Erwinia Carotovra. Silice týchto rastlín potlačujú rast vybraných rastlinných patogénov (Kalemba a Kunicka, 2003).

Abo El-Seoud et al. (2005) zistili, že silice z mäty, citróna a eukalyptu inhibujú rast Erwinia Carotovra.

Karvakrol pri koncentrácii 50 mg.ml^-1 najviac potláčal rast Agrobacterium tumefaciens a Erwinia Carotovra (El-Zemity et al., 2008).

Podobné výsledky zaznamenal aj Penalver et al. (2005), ktorí zistili, že silice s vyšším obsahom fenolických zložiek (karvakrol a tymol) najviac potláčajú rast mikroorganizmov.

Ahmed a El Zemity (2005) zistil, že karvakrol, tymol a eugenol rastlinných silíc vykazujú naviac aj antifungicídnu aktivitu. Predpokladá sa, že biologický účinok týchto silíc spočíva v interakcii s bunkovými membránami patogénnych baktérii (Burt, 2006).

Rastlinné silice ovplyvňujú permeabilitu fosfolipidovej dvojvrtsvy bakteriálnych buniek čím zvyšujú permeabilitu membrány a stratu bunkových organel (Utee et al., 1999) rovnako ako aj poškodenie enzýmových systémov zodpovedných za produkciu energie a syntézu štrukturálnych zložiek bunky (Beuchat, 1994).

Vyššie množstvo monoterpenoidov sa môže rozpustiť vo fosfolipidovej dvojvrstve, čím tieto lipofilické zložky narúšajú integritu membrány, výmenu iónov a funkciu proteínov a enzýmov nachádzajúcich sa v tejto membráne a tým spôsobiť zánik bunky (Sikkema et al., 1995).

Po pridaní tymolu, karvakrolu a cynamaldehydu a eugenolu boli zaznamenané zmeny v zložení mastných kyselín membrány bakteriálnych buniek, čo následovne viedlo k poškodeniu membrány a smrti bunky (Di Pasqua et al., 2006).

Patogénne huby infikujú zrná aj celé rastliny, a tým spôsobujú poškodenie rastlinných produktov a potraviny vyrobené z týchto produktov (Pande et al., 2004).

Tento fakt je dôležitý aj z hľadiska výroby a skladovania krmív, kedže tie sú veľmi často napádané patogénnymi hubami, čo sa môže odraziť na zdraví zvierat, ktorým sú tieto krmivá podávané.

Mnohé látky, ktoré chránia rastliny a úrodu pred patogénnymi hubami sú určené pre humánnu medicínu a je nutné ich nahradiť bezpečnými a biodegradovateľnými produktmi pochádzajúcimi z prírodných zdrojov (Cutler a Hill., 1994).

Mnohé rezídua pochádzajúce z pesticídov predstavujú oveľa vyššie riziko v porovnaní s insekticídmi a herbicídmi spolu. Rezistencia patogénov na pesticídy vytvára nové možnosti pre použitie alternatívnych rastlinných zdrojov. Rastlinné extrakty a silice predstavujú alternatívne riešenie z hľadiska ich antifungálnej aktivity voči širokej škále patogénnych húb (Rice, 1995).

Medzi týmito látkami sú aj silice, ktoré predstvaujú relatívne bezpečie

Vo výskume zameranom na overenie antifugálnej aktivity viac ako 20 silíc získaných z liečivých rastlín bol zistený inhibičný vplyv na Sclerotium rolfsii a Rhizoctonia bataticola (Sharma et al., 2009).

Pri vyhodnocovaní schopnosti silíc inhibovať Sclerotium rolfsii a Rhizoctonia bataticola bol zistený vysokopozitívny účinok silice Acorus calamus (Marongiu et al., 2005).

Phongpaichit et al. (2005) zistili, že základnou zložkou Acorus calamus, ktorá zodpovedá za antifungicídnu a antibakteriálnu aktivitu, je ß-asalon.

Silice z Betiveria zizanioides kusimol a ß-vetivon, ktoré sú jej základnou zložkou boli potvrdené ako látky s antimikrobiálnou aktivitou (Kim et al., 2005).

Na základe literárnych poznatkov je známe, že rastlinné silice získané z určitých druhov rastlín prejavujú antifungálnu aktivitu.

7. 
   Geneticky modifikované organizmy a ich detekcia
   

8. 
   Použitie geneticky modifikovaných organizmov na Slovensku
   

Hlavnými bezpečnostnými opatreniami sú princíp predbežnej opatrnosti, permanentné monitorovanie z hľadiska ochrany biodiverzity, zdravia ľudí, zvierat a rastlín.

Do Európskej únie i na Slovensko sa vždy dovážali milióny ton sóje a jej produktov a tento trend sa nezmenil ani po roku 1996. Je však nutné poznamenať, že
na svetovom trhu predstavuje až 2/3 transgénna sója. Do Európy sa dováža a používa sa ako surovina kŕmnych zmesí.

Vo výžive zvierat a človeka je ťažké predpokladať evidentné rozdiely spôsobené eventuálnymi zmenami na úrovni primárnej štruktúry deoxyribonukleovej kyseliny

Degradácia DNA z diéty nie je v tráviacom trakte zvierat úplná a z toho dôvodu sa nedá vylúčiť, že fragmenty génov sa dostávajú do epitelu čriev a organizmus hostiteľa ich absorbuje. Príjem DNA s potravinami v normálnej strave človeka kolíše medzi 0,1 až 1,0 g na deň. Dojnica príjme 50,0 g DNA, ošípaná a brojler 0,1–0,5 g DNA denne (Phipps a Beever, 2000).

K množstvu DNA prijímaného diétou je potrebné pripočítať podobné množstvá DNA pochádzajúce z mikrobiálneho osídlenia zažívacieho traktu. Podľa toho sú ľudia i zvieratá už milióny rokov mnohorakým spôsobom konfrontované s „cudzou DNA“ (Sochová et al., 2005). Pri genetických zmenách sa obyčajne k cca 30 000 génom pridáva jeden až štyri nové. Začlenením len jedného cudzorodého génu do genetickej výbavy rastliny vzniká transgénna rastlina.

Vzniknutý organizmus sa preto líši od pôvodného len nepatrne. Teda zmeny spôsobené génovými technológiami postihujú len nepatrnú časť genómu. Napriek dokázanému prechodu úlomkov DNA z krmiva do zvieraťa neboli ešte doteraz nájdené žiadne úlomky, ktoré by pochádzali zo zmien spôsobených génovými technológiami. Prenos DNA do organizmu je potrebné považovať za sústavný proces a nie za špeciálny problém genetických zmien (Chrenková a Chrenek, 2008).

9. 
   Metódy detekcie GMO
   

Imunologické techniky s antigénmi sú ideálne pre kvalitatívne ako aj kvantitatívne detekcie mnohých typov bielkovín, ak je cieľový prvok už známy (Brett et al., 1999).

Obe monoklonálne ako aj polyklonálne protilátky môžu byť použité v závislosti od potrebného množstva a špecifity detekčného systému v závislosti od aplikácie, času a finančnej náročnosti. Imnologické metódy dokážu detekovať prítomnosť cudzorodej bielkoviny v rastlinných tkanivách v rozmedzí 1 % GMO (Stave, 1999).

Wester blotting je vysoko špecifická metóda, ktorá zabezpečuje kvalitatívne výsledky vhodne pre vyhodnotenie množstva cieľového proteínu pod alebo

Detekčný limit pri Elise je pre bielkovinu surovej sóje 0,25 % a pre pripravované jedlo 1,4 % (Gupta, 2000).

Kvalitatívna polymerázová reťazová reakcia využíva špecifitu DNA polymerázy na zabezpečenie selektívnej amplifikácie špecifického segmentu DNA objavujúceho sa v komplexe iných DNA segmentov (Ahmed, 1995).

V štandardných PCR testoch sa používajú 2 typy primerov. Tieto primery sú konštruované tak, aby sa hybridizovali na opačných vláknach ako je sekvencia záujmu  cez sériu opakujúcich sa cyklov, 2–3 teplotné kroky sa úsek medzi primermi amplifikuje milión krát. Produkt je možno overiť elektroforeticky v agarózovom géli. Veľkosť produktu musí zodpovedať počtu bázových párov medzi navrhnutými primerami na DNA vlákne. Produkt môžno overiť aj použitím vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a kapilárnou elektroforézou (De Palma, 2001).

PCR analýza bola použitá na testovanie viacerých potravín ako napríklad ryža , paradajky, pšenica, zemiaky. Dôležitá je DNA extrakcia a purifikácia. V súčastnosti existuje viacero metód extrakcie DNA aj keď najpoužívanejšia je metóda CTAB založená na inkubácii potravinovej vzorky v prítomnosti detergentu cetyltrimetylamonium brómidu (Ahmed, 2002).

Real-time PCR umožňuje monitorovať amplifikačnú reakciu počas jej priebehu (v reálnom čase) v uzavretom priestore bez zásahu do výsledku prebiehajúcej reakcie. Fluorescenčný signál korešpondujúci so stúpajúcim množstvom amplifikovaného produktu môže byť meraný a vizualizovaný na počítačovej obrazovke. Software

Aby boli odstránené nedostatky bežnej PCR vznikla real-time PCR (Ahmed, 2002).

Teoreticky by mali produkty PCR postupovať exponenciálne. V realite však dosahuje iba rozsah 30–40 cyklov pretože niektoré dôležité komponenty PCR sa stávajú limitujúce (Ahmed, 1995).

V konvenčnej PCR sú produkty merané iba v jednom bode reakčného profilu. Štatistika medzi konvenčnou a real-time PCR ukazuje, že presnosť v kvantifikácii je lepšia u real-time PCR. Bolo však dokázané, že koncentrácia DNA pri reakciách real-time PCR je proporcionálna ku počtu cyklov konvenčnej PCR v exponenciálnej fáze (Ahmed, 2000).

Real-time PCR umožňuje detekciu aj malého množstva DNA. Mnohé komerčne dostupné real-time PCR termocykléry automatizujú analytickú procedúru, ktorou sa monitoruje kinetika reakcie. Umožňuje kalkuláciu cieľovej sekvencie krok
za krokom (Ahmed, 2000).

Spolu 179 potravinárskych produktov obsahujúcich geneticky modifikovanú sóju bolo testovaných real-time PCR. Táto metóda sa ukázala dostatočne citlivá. Amplifikovaná DNA však nebola detekovaná v tukoch a olejoch. Genetická modifikácia bola stanovená v 34 vzorkách, pričom 8 z nich obsahovalo menej ako 1 % geneticky modifikovanej sóje (Hagen a Beneke, 2000).

Z literárnych poznatkov vyplýva, že sú známe biotechnologické postupy
na detekciu a kvantifikáciu geneticky modifikovanej zložky krmiva.

10. 
    Cieľ práce
    

V doktorandskej dizertačnej práci sme si stanovili dva základné ciele:

1. 
   skúmanie vplyvu zmesi pamajoránovej silice a probiotika na báze Enterococcus faecium na osídlenie črevnej mikroflóry, na prítomnosť mikroskopických vláknitých húb v kŕmnych zmesiach určených
   pre brojlerové kurčatá a biochemické ukazovatele krvi brojlerových kurčiat,
   
2. 
   detekcia a kvantifikácia prítomnosti geneticky modifikovanej sóje v kŕmných zmesiach určených pre brojlerové kurčatá.
   

1. 
   určenie účinnosti pamajoránovej silice,
   
2. 
   vykonanie experimentov s kurčatami určenými na produkciu mäsa,
   
3. 
   sledovanie vplyvu zmesi pamajoránovej silice + probiotika, pamajoránovej silice a probiotika v porovnaní s kontrolnou skupinou na:
   

• 
  počet Lactobacillus sp., Enterococcus sp. a koliformných baktérií v chýmuse slepých čriev,
  
• 
  počet mikroskopických vláknitých húb v kompletných kŕmnych zmesiach HYD-01, HYD-02 a HYD-03,
  
• 
  obsah vápnika, fosforu, horčíka, celkových bielkovín, cholesterolu a triacylglycerolov v krvi.
  

1. 
   detekcia prítomosti geneticky modifikovanej zložky sóje v kompletných kŕmnych zmesiach HYD-01, HYD-02 a HYD-03,
   
2. 
   kvantifikácia geneticky modifikovanej zložky sóje v kompletných kŕmnych zmesiach HYD-01, HYD-02 a HYD-03.
   

11. 
    Metodika práce a metódy skúmania
    

12. 
    Charakteristika objektu skúmania
    

Objektom skúmania boli pamajoránová silica, probiotiká a ich kombinácia, ktoré sme použili do kŕmnych zmesí pre kurčatá určené na produkciu mäsa. V experimentoch sme použili finálny výkrmový typ kurčiat Ross 308 a Cobb 500.

(Origanum vulgare) (URL 2)

(URL 1)

Postup zapracovania pamajoránovej silice a probiotika do pokusných kŕmnych zmesí

Pamajoránovú silicu (0,05 %) sme zmiešali s repkovým olejom, ktoré sme zhomogenizovali s kukuričným šrotom a následne s ostatnými kŕmnymi surovinami. Probiotikum (0,01 %) sme aplikovali do kŕmných zmesí ako kŕmny doplnok, ktorý bol primiešaný do kukuričného šrotu a následne zmiešaný s ostatnými kŕmnymi surovinami.

Probiotikum na báze Enterococcus faecium je registrovaný v EÚ ako Broilers N° EU 18. Koncentrácia Enterococcus faecium bola 10⁹ KTJ.g^-1 produktu. Je to lyofilizovaný produkt, ktorý je odolný voči pH v žalúdku a voči granulácii. Enterococcus faecium je v produkte chránený vrstvami polysacharidov. Pomocou receptorov priľne ku stene čriev, na ktorej vytvára ochrannú vrstvu.

Pamajoránovú silicu sme zmiešali s repkovým olejom, potom sme zhomogenizovali s kukuričným šrotom, primiešali sme probiotikum a túto zmes sme zhomogenizovali s ostatnými surovinami kŕmnych zmesí.

Kŕmne zmesi

Kŕmne zmesi sme namiešali v krmivárskej firme Biofeed, a. s., Kolárovo.

Overovali sme kŕmne zmesi určené pre kurčatá na produkciu mäsa, štartérovú HYD-01, rastovú HYD-02 a finálnu HYD-03.

Zloženie kŕmnych zmesí z vhodných kŕmnych surovín je uvedené (tabuľke č. 1) a

obsah živín a metabolizovateľnej energie v kŕmnych zmesiach je tabuľka č. 3.

13. 
    Pracovné postupy
    
    
    
14. 
    Uskutočnené experimenty
    

Celkové experimentálne obdobie sme rozdelili na tri fázy:

1. 
   štartérová, určená pre kurčatá vo veku od 1. do 18. dňa, počas ktorej kurčatá prijímali štartérovú kŕmnu zmes (HYD-01-KZ),
   
2. 
   rastová, pre kurčatá vo veku 19 až 31 dní s rastovou kŕmnou zmesou HYD-02-KZ,
   
3. 
   finálna, pre kurčatá vo veku 32 až 38 dní s finálnou kŕmnou zmesou HYD-03-KZ.
   

Zloženie kŕmnych zmesí a obsah živín v jednom kg kŕmnych zmesí sú uvedené v tabuľke č. 1, 2 , 3.

V experimentoch sme použili vlastnú pokusnú kŕmnu technológiu. Kurčatá

Svetelný režim bol nastavený automatickým svetelným zariadením podľa odporúčania pre finálny výkrmový typ kurčiat Ross 308 a Cobb 500, a to počas prvých 7 dní svetelný svit na 24 hodín, počas 8.9. dňa experimentu na 23,5 hodiny, počas 10.11. dňa na 23 hodín, počas 12.–13. dňa na 21 hodín a od 14. dňa až dokonca experimentu na 20 hodín.

Vetranie v hale bolo zabezpečené pomocou vetracieho systému umiestneného v strope haly.

Tab. 4

Odporúčané teploty pre brojlerové kurčatá

Vek kurčiat (deň)	Teplota (°C)
Ross 308 Cobb 500	Ross 308 Cobb 500
1	33,0
3	30,5
6	28,5
9	27,0
12	26,5
15	25,0
18	23,5
21	22,0
24	21,0
27	20,5
30	20,0
33	19,5
36 a viac	19

Uskutočnili sme 3 skupinové, sériové experimenty s brojlerovými kurčatami Ross 308 a Cobb 500 (tabuľka 5) .

15. 
    Spôsob získavania údajov a ich zdroje
    

16. 
    Sledované ukazovatele
    

- obsah karvakrolu v pamajoránovej silici a antioxidačná aktivita pamajoránovej silice,

- obsah živín a metabolizovateľnej energie v kŕmnych zmesiach,

- počet Lactobacillus sp., Enterococcus sp. a koliformných baktérií v chýmuse slepých čriev brojlerových kurčiat,

- charakteristika a počet mikroskopických vláknitých húb v krmných zmesiach,

- biochemické ukazovatele krvi:

• 
  obsah vápnika,
  
• 
  obsah fosforu,
  
• 
  obsah horčíka,
  
• 
  obsah celkových bielkovín,
  
• 
  obsah glukózy,
  
• 
  obsah triacylglycerolov,
  

- kvantifikácia geneticky modifikovanej zložky sóje v krmivách.

2. 
   Spôsob sledovania ukazovateľov