Ana səhifə

MasarykovA univerzita přírodovědecká fakulta


Yüklə 193.1 Kb.
tarix26.06.2016
ölçüsü193.1 Kb.



masarykovA univerzitA

Přírodovědecká fakulta
centrum pro výzkum toxických látek v životním prostředí

(Bio)senzory pro sledování hormonálně aktivních látek (endokrinních disruptorů) v prostředí


Zuzana Bílková


Bakalářská práce


Vedoucí: Doc. RNDr. Luděk Bláha, PhD.

Brno, Česká republika, rok 2011

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně

s využitím uvedených literatury, kterou uvádím v seznamu.
……………………………………………..

Mé poděkování patří panu docentu RNDr. Luďku Bláhovi, PhD., který vedl mou práci a byl ochoten mi poskytnout cenné rady a připomínky.




Obsah


Obsah 5

Seznam použitých zkratek 6

  1. Úvod 7

  2. Biosenzory 8

    1. Definice biosenzoru 8

    2. Konstrukce biosenzoru 8

    3. Využití biosenzorů v životním prostředí 10

    4. Typy biosenzorů 11

    5. Biosenzory v praxi 15

  3. Endokrinní disruptory 17

    1. Mechanismus působení endokrinních disruptorů v těle 18

      1. Nepřímé účinky 18

      2. Přímé reakce s receptorem 18

        1. Interakce toxických látek s receptorem 19

    2. Látky způsobující endokrinní disrupci 21

    3. Metody sledování EDC v prostředí 24

  4. Biosenzory pro detekci endokrinních disruptorů 27

    1. Toxicita a genotoxicita 27

    2. Endokrinní efekt 28

    3. Biosenzory pro specifické EDC 29

  5. Závěr 34

Anotace 35

Seznam použité literatury 36

Seznam použitých zkratek:


AhR

AChE

AP

APEC

APEO

AR

ARE

BaP

BChE

BSK

DDE

DDT

DH

DHT

DNA

EDC

ER

ERE

GC

HPCL
HRE

HSP

NADH

PAH

PBB

PCB

PVC

SPR

TBT

TR


arylhydrokarbonový receptor

acetylcholinesteráza

alkylfenol

alkylfenolethoxylátový derivát

alkylfenolethoxylát

androgenní receptor

androgen respons element (úseky DNA spouštějící androgenní odpověď)

benzo(a)pyren

butyrylcholinesteráza

biologická spotřeba kyslíku

dichlorodifenyldichloroethylen

dichlordifenyltrichlormethylmethan

dehydrogenáza

dihydrotestosteron

deoxyribonukleová kyselina

endocrine disruptor chemical (endokrinní disruptor)

estrogenní receptor

estrogen respons element (úseky DNA spouštějící estrogenní odpověď)

gas chromatography (plynová chromatografie)

high-performance liquid chromatography (vysokotlaká kapalinová chromatografie)

hormonal respons element (úseky DNA spouštějící hormonální odpověď)

heat shock proteins (stresové proteiny, proteiny teplotního šoku)

nikotinamid adenin dinukleotid dehydrogenáza

polycyclic aromatic hydrocarbon (polycyklický aromatický uhlovodík)

polybromované bifenyly

polychlorované bifenyly

polvinylchlorid

surface plasmon resonance (povrchová plasmonová resonance)

tributiltin (tribuylcín)

thyroidní receptor




  1. Úvod

Každým rokem se stovky látek dostávají do životního prostředí, aniž by byla známa jejich toxicita a nebo dopad na lidské zdraví. V poslední době je velká pozornost věnována endokrinním disruptorům, látky působící na hormonální systém, napodobují nebo blokují funkci hormonů nebo narušují jejich metabolismus. Proto je tyto sloučeniny potřeba sledovat. V posledních letech bylo provedeno mnoho studií zkoumajících tyto látky pomocí biotestů, analytických metod, apod.

Cílem této práce je vypracování přehledu rychlých metodik pro sledování endokrinních disruptorů (EDC) v životním prostředí.

Práce shrnuje problematiku a využití různých typů biosenzorů. Obsahuje přehled typů biosenzorů použitelných v enviromentální toxikologii. Seznamuje také s problematikou endokrinních disruptorů, s jejich působením na buněčné úrovni a s následným efektem na celý organismus. Podrobněji je popsán mechanismu interakce EDC s jadernými receptory (androgenní receptor, estrogenní receptor).


  1. Biosenzory




    1. Definice biosenzoru

Chemický senzor je analytický přístroj, který převádí vstupní proměnnou vlastnost na signál vhodný k měření. Je citlivý na chemické látky v okolí. Poskytuje informace o chemickém složení okolí.

Biosenzory jsou chemické senzory, které obsahují citlivý prvek biologického původu tzv. biorekogniční složku (rozpoznávací systém založen na biochemickém mechanizmu). Ta je buď součástí a nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupin) chemických látek ve vzorku. Biorekogniční složka má za úkol styk s testovaným vzorkem. Chemicko-fyzikální převodník poskytuje signál, který je možno dále zpracovat. [Thevenot et al., 1999]


    1. Konstrukce biosenzoru

Biosensory jsou obecně složeny ze dvou částí: biorekogniční složka a fyzikálně-chemický převodník. Jeho schématické uspořádání je uvedeno na obrázku 1. (Medical Electronics Laboratory1 uvádí 3 komponenty, kde tou třetí je přístroj zpracovávající signál např. počítač)



a) Biorekogniční složka

Je v přímém kontaktu s analytem. Rozlišují se dva typy biologické složky podle typu reakce.

1. Biokatalytická reakce (enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, organismus) Stanovovaná látka je rozlišována tím, že je specificky přeměňována v průběhu chemické reakce.

2.Bioafinitní reakce (lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor)

V tomto případě je látka specificky vázána v afinitním komplexu.
Nedílnou součástí je imobilizace biologického materiálu. Biomolekuly musí být zachyceny na pracovním povrchu. K tomu nejčastěji slouží membrány. Další výhodou membrán je zajištění mechanické stability a biokompatibility povrchu biosenzoru s biologickým materiálem. Několik z mnoha používaných materiálů jsou např. polyvinylchlorid, polyestersulfonát nebo acetylcelulóza. K zachycení biomolekul dochází několika možnými způsoby. Zde uvádím jen některé příklady: mechanické uchycení, mikrozapouzdření (záchyt mezi dvěma membránami) nebo zachycení přímo na povrchu senzoru, kde vzniká kovalentní vazba (tato vazba je umožněna aktivací inertního povrchu ). Existuje řada dalších materiálů a metod imobilizace, tato práce se jimi dále nezabývá. [Skládal 2002]
b) Fyzikálně-chemický převodník

Převádí signál, který vyplývá z interakce mezi analytem a biorekogniční částí, na lépe měřitelný a vyčíslitelný elektronickou jednotkou . Výběr vhodného převodníku závisí na signálu biologického materiálu. Podle metody detekce lze převodníky (a tak i biosenzory) rozdělit do následujících skupin: elektrochemické, optické, gravimetrické, kalorimetrické. V literatuře bývá někdy převodník označován jako detektor, senzor nebo elektroda, pro pořádek je nejlépe užívat převodník (transducer). [Thevenot et al., 1999]

Nejvíce se využívají elektrochemické biosenzory. Hlavními výhodami jsou jednoduchá konstrukce měřícího systému, nízké pořizovací náklady a výborná citlivost. Pro sestavení elektrochemického měřícího systému je zapotřebí nejméně dvě elektrody, pracovní (měřící) a referentní (srovnávací). [Skládal 2002]
Obr. 1 Obecné schéma biosenzoru 2



    1. Vužití biosenzorů v životním prostředí

Využití biosenzorů je velmi široké. V životním prostředí se používají především pro zjišťování kvality ovzduší, detekce škodlivin v odpadních vodách, kvality pitné vody nebo půdy, jak je uvedeno v tabulce 1. V důsledku rozvoje průmyslu a činnosti člověka byly a jsou do životního prostředí vypouštěny nebezpečné látky ze spalovacích nebo výrobních procesů. Pesticidy, těžké kovy či PCB způsobuji všeobecně známé znečištění životního prostředí. Z důvodu potřeby detekce těchto látek byly vyvinuty různé typy biostestů, chemických analýz, apod. Kromě tohoto testování je k rychlému stanovení obecných kvalitativních parametrů, jako BSK a hodnocení biologického znečištění patogenními organismy, v současné době možné použít metody založené na biosenzorech.

Pro organofosfáty a karbamátové pesticidy se používá enzymatických biosenzorů na základě činnosti cholin oxidázy a na inhibici acetylcholinesterázy (AChE) a butyrylcholinesterázy (BChE). U těžkých kovů to jsou celo buněčné biosensory, které jsou schopné reagovat na velmi malá množství přítomných iontů kovu, jako rekombinantí s luminiscenčními bakteriemi.[Iavicoli et al., 2009] Pomocí biosenzorů mohou být detekovány i ostatní dobře známé kontaminanty, jako PCB a dioxiny, fenoly, povrchově aktivní látky, polycyklické aromatické uhlovodíky.

Znečištění není způsobeno pouze průmyslovým zatížením, ale spousta látek uvolňovaných do živ. prostředí pochází z činnosti člověka, což je neregulovatelné. Jsou to látky každodenního života (antikoncepce-hormony, steroidy, antibiotika, saponáty-povrchově aktiv.látky, benzí,…). Tyto látky jsou obzvláště nebezpečné z důvodu jejich hojného používání a působení na hormonální systém. Bakterie se dokonce mohou stávat rezistentní vůči některým přípravkům, především léčivům. [Rodriguez-Mozaz et al., 2005]

Tab.1 Biosenzory použité pro stanovování znečišťujících látek [Rodriguez-Mozaz et al., 2003]


Typ převodníku




Matrix

Analyt

Elektrochemický

Potenciometrický

Většinou voda(povrchová, pitná,..), nebo výluh z půdy, dále i vzduch

těžké kovy, kyanidy, stanovení BSK, povrchově aktivní látky, znečišťující plyny (CO2)

Ampérometrický

těžké kovy, organofosáty, fenol a jeho deriváty, halogenidi, kyanidy, genotoxické látky, progesteron, povrchově aktivní látky, toxicita,

Konduktometrikcý

těžké kovy, organofosfáty

Optický




těžké kovy, pesticidy a herbicidy (atrazin, fenoly, triazin), EDC (hormony, bisfenol A, alkylfenoly, antibiotika

Gravimetrické

(akustické)



Piezoelektrický

organofosfáty, EDC, patogenní organismy

Kalorimetrický




těžké kovy



    1. Typy biosenzorů

Tato kapitola se věnuje podrobněji základním typům biosenzorů, jak již bylo nastíněno v kapitolo 2.2. Biosenzory se dělí buď podle typu biorekogniční složky a nebo podle typu přenosu signálu. Tabulka 2 uvádí jednotlivé typy biosenzorů. V následujících odstavcích bylo čerpáno z těchto zdrojů: [Kotzian, P. 2007], [Skládal 2002], [Bidmanová 2007].


Tab. 2 Typy biosenzorů podle dle převodníku nebo biomolekuly 3


Převodník




Elektrochemický

potenciometrie

ampérometrie

konduktometrie

(impedimetrie)



Optický

absorpce

fluorescence/fosforescence

bio/chemiluminiscence

index lomu

Ramanův rozptyl


Gravimetrické

(akustické)



piezoelektrické


Kalorimetrický




Typ biomolekuly




Protilátky

imunosenzory

Proteinové receptory




Celé buňky (mikrobiální, savčí, tkáň)

mikrobiální senzory

Nukleové kyseliny

DNA senzory

Enzymy

enzymová elektroda




Elektrochemický biosenzor

Základním principem pro tuto třídu biosenzorů je to, že řada chemických reakcí spotřebovává nebo produkuje elektrony či ionty, což způsobuje změny v elektrických vlastnostech, které se dají měřit. Elektrochemické biosenzory jsou založeny na měření elektrických parametrů: konduktometrie, amperometrie a potenciometrie. K tomu slouží nejméně dvě elektrody: pracovní (měřící) a referentní (srovnávací bod k měření nebo k nastavení potenciálu pracovní elektrody).4



  1. Konduktometrie

Je to metoda založena na měření elektrické vodivosti/odporu v roztoku při použití elektrického pole. Při elektrochemické reakci jsou produkovány ionty nebo elektrony a tím pádem se mění i celková vodivost. Konduktometrie má relativně nízkou citlivost.

  1. Amperometrie

V tomto případě je měřený parametr proud. Vysoce citlivý biosenzor dokáže detekovat elektroaktivní látku vyskytující se v biologickém vzorku. Látkami mohou být substráty reakcí (O2, NADH), produkty (H2O2, benzochinon) nebo elektrochemické mediátory , které můžou přímo přenášet elektrony z enzymu na pracovní povrch elektrody.

  1. Potenciometrie

U tohoto typu senzoru je měřen elektrochemický potenciál oxidace nebo redukce.

Potenciometrické biosenzory se skládají z iontově-selektivní elektrody (pH, amonné, chloridové,..) nebo plynové elektrody (pCO2, pNH3) potažené biologickou vrstvou. Měří se změna napětí na elektrodách, kterou vyvolává elektrochemická reakce vyvolaná biologickým prvkem.


Optický biosenzor

Optické biosenzory jsou nejčastěji používané po amperometrických a potenciometrických biosenzorech. Měřeným signálem je změna světelného záření, která je některým optickým jevem jako: absorpce světla, fluorescence, chemiluminiscence, index lomu, Ramanův rozptyl. Změnu světelného záření vyvolá reakce biorekogniční složky se zkoumaným analytem.

Nejčastěji používaným optickým biosenzorem, pro účely detekce škodlivých látek v životním prostředí, jsou optické převodníky založené na povrchové plasmonové resonanci (SPR). Jsou vhodné pro přímé optické snímání. Světlo vstupující do přístroje je směřováno na snímáný povrch a pak se odráží zpět ven. Světlo vycházející z přístroje je pak sledováno, jsou zaznamenány změny, které na povrchu nastaly.

Příklad: V optickém přístoji založeném na difrakci, je křemíková deska potažená proteiny kovalentní vazbou. Deska je vystavena UV záření skrze foto-masku. Tím se protilátky ve vystavených oblastech stávají inaktivní. Když jsou křemíkové plátky inkubovány v analytu, dojde v aktivní oblasti k vytvoření vazby antigen-protilátka a vzniká tak difrakční mřížka. Tato mřížka vytváří difrakční signál, když je ozářena světelným zdrojem jako např.laser. Výsledný signál může být měřen nebo před měřením se může zesílit pro zvýšenou citlivost.


Gravimetrický bioseznory

U tohoto biosenzoru je snímač akustické vlny spojen s protilátkou. Když se molekula analytu (antigen) napojí na membránu s protilátkou, nastane změna hmotnosti membrány, která se dá měřit. Je změněn rezonanční kmitočet převodníku. Tato změna frekvence je pak měřena. Nejčastější se používají piezoelektrické biosenzory, které pracují na základě oscilace krystalu, který rezonuje na frekvenci 9-14 MHz. Jsou konstruovány z křemene.


Konduktometrický biosenzor

Konduktometrický biosenzor využívá základních vlastností biologických reakcí (enzymatických reakcí), a to teplotní změny a adsorpce. Jsou konstruovány tak, že na teplotní čidlo jsou imobilizovány molekuly enzymu. Při kontaktu analytu s enzymem dojde ke vzniku tepla a přítomný termistor (snímač cilivý na teplo) tuto reakci zaznamená. Celkové vyrobené nebo absorbované teplo je přímo úměrné molární entalpii a celkovému počtu molekul v reakci.



    1. Biosenzory v praxi

I přes velké množství biosenzorů, které jsou ve vývoji a nebo je teprve o nich spousta odborných publikací, jsou v současné době na trhu již některé praktické systémy. Prvním úspěšným komerčním biosenzorem je ,,glukózové pero“, kterou zahájila Exactech v roce 1987. V dnešní době 90 % tržeb přichází z biosenzorů detekující glukózu pro lékařské použití. Nicméně v jiných oblastech např. potravinářství, zemědělství, armádě a životním prostředí nebyly podle dostupných informací komerční biosenzory ve větší míře zavedeny. Mnoho instrumentací vyvinutých pro medicínskou diagnostiku by mohlo být upraveno pro monitorování životního prostředí. I když ekonomické výnosy biosenzorů pro životní prostředí nebudou tak velké jako z lékařské diagnostiky, jejich vývin je podporován. Je vyvinuto výzkumné úsilí zaměřené na aplikace biosenorů pro měření znečišťujících látek a dalších enviromentálních rizik (toxicita, endokrinní disrupce,..). [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]

Lze říci že biosenzory dnes úspěšně vystoupily z výzkumných laboratoří do reálného světa; nicméně přes řadu dosažených úspěchů bude na tomto poli ještě řadu let co objevovat a zlepšovat.[ Skládal, P., Macholán, L. 1997]
Komerčně dostupný biosenzor je nejčastěji založen na povrchové plasmonové resonanci (SPR). Tento biosenzor tvoří nejúspěšnější typ komerčních nástrojů pro monitorování životního prostředí. Průkopník biosenzorů založených na SPR byl představen firmou Pharmacia Biosensor AB, nyní Biacore AB (Uppsala, Švédsko), který představil původní BIAcore systém v roce 1990. Společnost má nyní širokou škálu biosenzorů, které zahrnuje několik typů původních BIAcore systémů (série 1000, 2000, 3000), jakož i další konfigurace sytému, které nabízejí různé stupně automatizace a specifikace parametrů. BIAcore 3000, který je založen na SPR principu, monitoruje biomolekulární interakce, jak postupují v průběhu času. Výhodou této metody je, že není třeba označovat reaktanty. V roce 1998-1999 asi 90% publikací uvádělo použití BIAcoru.

Další komerční biosenzory založené na SPR poskytují Windsor Scientific, Ltd. (Berks, UK), který uvádí na trh IBIS systém a Nippon Laser and Electronics Labs (Hokkaido, Japan) se systémem CELLIA (konfigurovány pro celé buňky nebo makromolekuly). Dále Texas Instruments (Dallas, TX) s detektorem Spreeta, konfiuorvané pro průmyslové, ekologické a biologické aplikace. BioTul AG (Mnichov, Německo), zahájili svůj nástroj Plasmon SPR v srpnu 1999. Na druhou stranu Affinity Sensors (Franklin, MA) vyrábí nástroje IAsys, které používají technologii tlumených vln v kontrastu s REMEDIOS, celobuňečné biosenzory použité pro diagnostiku kontaminovaných oblastí a půd. Detekují úroveň toxicity, která ovlivňuje metabolickou aktivitu organismu. Za normálních podmínek biosenzor vyzařuje viditelné světlo. Světelný výkon je přímo úměrný metabolické aktivitě. Jestliže vzorek (voda, půda, sediment, kal) je toxický, bioluminiscence poklesne přímosměrně s úrovní toxicity. Organismy pro biosenzory jsou vybrány jako zástupci bakteriálních kmenů vyskytujících se v životním prostředí, jakož i ty zapojeny do procesu bioremediace (přeměna toxických látek na netoxické působením bakterií). [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]




  1. Endokrinní disruptory

V posledních letech vědecký výzkum ukazuje, že látky v životním prostředí mohou narušovat přirozenou funkci endokrinního systému lidí a volně žijících zvířat. Tyto látky se v přírodě vyskytují buď z důvodu činnost člověka (xenoestrogeny), např. průmyslové odpady, pesticidy, herbicidy a nebo se v přírodě nacházejí přirozeně (fytoestrogeny). Vědci předpokládají, že i nepatrné množství těchto látek je schopno narušit endokrinní systém a způsobit rakovinu, poškození samčího nebo i samičího reprodukčního systému a další nepříznivé vlivy. Proto se tyto látky nazývají endokrinní disruptory.

V květnu 1997, US Environmental Protection Agency (EPA) a pracovní skupina pro endokrinní disruptory (EDSTAC) se shodli na následující pracovní definici:
"Endokrinní disruptor je exogenní chemická látka nebo směs, která mění strukturu nebo funkci endokrinního systému, a tak způsobuje nežádoucí účinky na úrovni organismu, jeho potomstvu, populaci, nebo subpopulaci organismů, vycházející z vědeckých poznatků, dat, závažnosti důkazů, a ze zásad předběžné opatrnosti."
V životním prostředí mohou být zvířata brána jako tzv. bioindikátory k monitorování znečišťujících látek v prostředí. Aby se lépe porozumělo důsledku kontaminantů v životním prostředí a dopadu na ekosystém, byly prostudovány nemoci a změny počtu volně žijících živočichů (ptáci, ryby,..). [Thevenot et al., 1999]

Účinky endokrinních disruptorů byly zjištěny na rybách.Ty se vyskytují ve vodním prostředí, kde jsou vypouštěny odpady z továren a splachy z půd. Škodliviny se k rybám mohou dostávat skrze kůži a dýchání. Jsou známy sexuální abnormality včetně snížení velikosti pohlavních žláz, opožděné pohlavní zralosti a snížené schopnosti se rozmnožovat. V závislosti na látce může docházet k feminizaci samců nebo maskulinizaci samic. Např. feminizace může být způsobena estrogenními sloučeninami obsaženými v odpadních vodách vypouštěných z papíren nebo z důvodu užívání antikoncepce.5

Dopad na životní prostředí a tak i na člověka nemůžeme domyslet. Proto bychom měli být opatrní na to co vypouštíme z továren, domácností nebo jaké se používají hnojiva či jiné postřiky v zemědělství.


    1. Mechanismus Působení endokrinních disruptorů v těle

Vzhledem ke komplexní povaze endokrinního systému je zřejmé, že externí podněty, jako expozice xenobiotik, které napodobují endokrinní činnost, mohou ovlivňovat jeho důležité funkce. Při prvním pozorování EDC v přírodě se vědci zaměřili na vysvětlení hlavních mechanismů pozorovaných účinků. Nejdůležitější z nich budou ve stručnosti představeny níže.6




      1. Nepřímé účinky

Tyto způsoby endokrinní disrupce jsou nezávislé na receptoru. Je ovlivňován např. transport hormonů, syntéza, degradace,…. Transport hormonů je ovlivňován tím, že se EDC vážou k transportním bílkovinám a ,,odstrkují“ přirozené hormony. Ty pak nikdy nedosáhnou svého cíle.

Dále např. Biosyntéza estrogenu je způsobena přeměnou testosteronu jistým enzymem na estrogen. Xenobiotika inhibují tento enzym, což vede k vyšší koncentraci testosteronu a nižší estrogenu.( U samic vodních živočichů byl sledován imposex tj. samice s typickými pohlavními znaky samců).

Detailní charakterizace těchto nepřímých účinků je mimo záměr bakalářské práce a podrobněji se věnuji spíše přímým interakcím látek s cílovými receptory. Tato interakce může být využita jako biorekogniční část při případné konstrukci senzorů, které jsou hlavním předmětem zájmu předkládané práce.




      1. Přímé reakce s receptorem




  1. Agonismus

Agonista je exogenní (vnější) činitel, který může tvořit vazbu s receptorem stejně jako přirozený substrát. Aktivace receptoru v konečném důsledku vede ke stejnému efektu, které mohou být způsobeny endogenním hormonem (produkovaným endokrinními žlázami). Účinnost exogenních činitelů závisí na jejich afinitě k receptoru. Každý hormon má svůj specifický receptoru, proto exogenní látky nemusejí automaticky vykazovat stejnou afinitu ke všem receptorům. Např. pro agonisty estrogenu jsou syntetické estrogeny diethylstilbestrol a ethynylestradiol , nazývané souhrnným názvem xenoestrogeny. [Lintellman et al., 2003]

  1. Antagonismus

Antagonista je ligand, který blokuje nebo snižuje odpověď vyvolanou agonisty, protože receptor nemůže být aktivován jako obvykle. Inhibice receptoru může být kompetitivní (tj. endogenní agonista a exogenní antagonista usilují o stejné účinné vazebné místo) nebo nekompetitivní (inhibitor se váže na receptor nebo receptor-hormon komplex , ale na jiné než vazebné aktivní místo). Kompetitivní inhibice může vést k totální deaktivaci receptoru, za to nekompetitivní inhibice zpomaluje reakci způsobenou receptorem nebo zeslabuje její účinky. Mezi typické antagonisty pro hormonální receptor patří např. linuron, vinklozolin a jejich metabolity nebo i farmaceutika jako tamoxifen, který se váže na androgenní nebo estrogenní receptor.

Ať v případě antagonistů nebo agonistů, v obou případech hraje velkou roli jejich koncentrace. Jelikož koncentrace endogenních hormonů jsou nízké, potom vysoký obsah xenobiotik v organismu vyvolává účinnou reakci endokrinních disruptorů i v případě nízké afinity exogenního ligandu k receptoru.




        1. Interakce toxických látek s receptorem

Nejlépe prostudovaným mechanismem je reakce toxické látky s receptorem. Endokrinní systém reguluje řadu buněčných procesů, mimo jiné stimuluje buňky k uvolňování chemických látek, ovlivňuje růst, produkuje bílkoviny. Všechny tyto akce začínají stejným krokem: hormon se váže na specifický receptor, který je na povrchu buněčné membrány, v cytoplasmě nebo v jádře. Po navázání na receptor dojde ke spuštění funkce hormonu. EDC s normálními hormony interferují a narušují jejich funkci.

Hormony se dělí podle schopnosti prostupovat cytoplasmatickou membránou. A to lipofilní, které mají receptory na povrchu buňky, ale i uvnitř a tím pádem mají schopnost prostupovat membránou. Mezi lipofilní se řadí především steroidní hormony (estrogeny, androgeny, progestiny,..). Membrána zabraňuje prostupu hydrofilních hormonů do buňky, a proto se jejich hormony nacházejí pouze na povrchu membrány. Jsou to například proteinové hormony (inzulín, růstový hormon,..). Většina studií se zaměřuje především na steroidní hormony a to estrogenní a androgenní, jejichž účinek probíhá cestou intracelulárních receptorů tzv.jaderných receptorů. [Giesy et al., 2002]

Receptory jsou rozděleny do 3 skupin: I.typ:receptory pro steroidní hormony, II.typ:AhR, TR, receptory pro retinoidy, III.typ:funkce zatím neurčena.


Estrogenní receptor (ER)

Estrogenní sloučeniny mají schopnost se vázat na ER a aktivovat jej. ER jsou především v jádře. Jako inaktivní se nacházejí v komplexech s asociovanými stresovými proteiny (HSP). Při vazbě estrogenní látky na ER tyto proteiny disociují a tak uvolní místo pro ligand. Receptor s ligandem dimerizuje. Tento komplex se váže na specifické úseky DNA, které jsou označovány ERE. Tyto úseky se nacházejí v promotoru (regulační oblasti) genů pro indukci estrogenní odpovědi buňky. Připojování dalších transkripčních faktorů k promotoru cílových genů vede ke zvýšení transkripce genů a syntéze proteinů potřebných k projevení hormonálního děje. Na obrázku 2 je uveden mechanismus působení EDC s ER. [Giesy et al., 2002]

Xenoestrogy napodobují funkci estrogenů (agonista) a (xeno)antiestrogeny pak působí jako antagonisté. [W. Singleton, D. W., Khan, S. A. 2003] Xenoestrogeny mohou způsobovat rakovinu prsu, u samců ryb způsobují feminizace, což vede ke snížení a poruchám reprodukce. [Truman, P.S., van den Hurk, P. 2010]

Obr.2 Mechanismus aktivace ER s přirozeným ligandem7




Androgenní receptor (AR)

Afinita androgenní vazby indukuje konformační změnu v AR, která je nezbytná ke stabilizaci před proteolytickou degradací. Nedávné zjištění naznačují, že AR ve svém aktivovaném stavu tvoří antiparalelní dimer. Po importu do jádra vzniká vazba androgen-AR. To vyvolává reakci, kdy se dimer napojuje na části DNA v oblasti ARE dochází k transkripci, což vyvolává androgenní odpověď. Obrázek 3 znázorňuje tento mechanismus.

Je to podobné jako u estrogenů. Xenoandrogeny fungují jako agonisti a (xeno)antiandrogeny mají antagonistickou fukci. Antiandrogenní látky narušují pohlavní vývoj samců. U samic měkkýšů při expozici xenoandrogenů docházelo k přerůstání samčích pohlavních orgánu přes samičí. [Stroben et al., 1992]
Obr.3 Mechanismus aktivace a další osud AR v buňce [Kelce, W. R., Wilson, E.M. 1997]



    1. Látky způsobující endokrinní disrupci

Mezi látky, které můžou vyvolávat endokrinní disrupci, patří běžně užívané prostřeky. Můžou to být chemikálie, které vypouštíme z domácností (detergenty, farmaceutika), různé pesticidy k hubení hmyzu, atd. V zemědělství to můžou být hnojiva nebo postřiky (herbicidy, insekticidy,..). Nemalou částí příspívají látky obsažené v odpadních vodách z továren (změkčovadla plastů, kovy). V tab.3. jsou uvedeny příklady látek, které lze - s ohledem na jejich použití a šíři dostupných vědeckých informací - považovat za nejvýznamnější reprezentanty endokrinních disruptorů


Tab.3 Látky s předpokládanou potencí pro endokrinní disrupci [Duft et al., 2004], [Iavicoli etal., 2009]


Pesticidy

Insekticidy

karbaryl, chlornan, DDT a DDE, dikofol, dieldrin, endosulfan, lindan, methoxychlór, mirex, oxychlordan, parathion, toxaphen, pyrethroid



Herbicidy

alachlor, amitrol, atrazin, metribuzin, nitrofen, linuron



Fungicidy

benomyl, fenarimol, maneb, vinklozin, zinek, TBT



Průmyslové chemikálie

alkylfenol, bisfenol A, dioxiny (2,3,7,8-TCDD), pentachlorfenol, ftaláty, PCB, PBB (polybromované bifenyly)



Detergenty (povrchově aktivní látky) alkylfenolethoxylát

Steroidy

Kovy Cd, Hg, As, Pb, Mn

Níže jsou uvedené, některé látky včetně jejich chemických struktur a způsobu mech působení na molekulární úrovni.



DDT

Je to známý pesticid, jehož používání bylo zakázáno ve většině zemí v roce 1970, ale stále se využívá v rozvojových zemích jako lék proti malárii. DDE je jeho známý metabolit, který je stálý a působí jako antiandrogen nebo xenoestrogen, kumuluje se v tukových tkáních. [Milla et al., 20011]




Obr.4 Dichlordifenyltrichlormethylmethan



Vinklozolin

Sloučenina s fungicidními účinky má antiandrogenní aktivitu a mění sexuální diferenciaci u samců potkanů. [Kelce 1997] Jeho dva metabolity M1 a M2 si vazebně konkurují na AR a inhibují DHT.



Obr. 5 3-(3,5-dichlorfenyl)-5-methyl-5 vinyloxazolidin-2,4-dion



Methoxychlor

Insekticid vykazující podobné schopnosti jako DDT. Ale jeho degradace je rychlejší a tak nedochází k bioakumulaci jako u DDT. Metabolit vykazuje estrogenní účinky. U volně žijících ptáků existují zprávy o zhoršení reprodukce. [Lintelmann et al., 2003]




Obr. 6 1,1,1-trichlor-2,2-di (4-methoxyfenyl) ethan]



Dioxin

Sloučenina z řady PCB, má antiestrogenní účinek. Vzniká při neúplném spalování především PVC. Při nižších dávkách může působit jako karcinogen. Reaguje s AhR, pro který nebyl nalezen endogenní ligand. Po přemístění do jádra působí jako transkripční faktor pro řadu genů. Aktivace AhR urychluje rozklad ER, což ovlivňuje koncentraci receptorů. [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]




Obr. 7 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo(b,e)(1,4)dioxin



Zearalenon

Mykotoxin s estrogenním účinkem. Napadá kukuřici a obilniny. Potravou se dostávají do těl zvířat, kde způsobují hyperestrogenní účinek.


Obr. 8




Chlordekon

Používal se jako insekticid (v ČR nebyl nikdy používán). Poškozuje reprodukční systém u pracovníků vystavených jeho vysoké koncentraci.8


Obr. 9 Dodekachlorpentacyklodekan




    1. Metody sledování EDC v prostředí

Bylo vyvinuto několik druhů metod pro sledování hormonálně aktivních látek v prostředí. Kromě instrumentálních chemických analýz (např. HPLC, GC... atd.) jsou ve výzkumu využívány biotesty. Jejich základní charakteristiaka je v této kapitole. [Eertmans et al., 2003], [Macíková, 2007]



In vitro testy

In vitro testy jsou nezbytné k identifikaci nových EDC a k objasnění jejich mechanismu účinku. Jsou citlivé, mají vysokou specifiku a jsou levnější než in vivo testy. Ale na rozdíl in vivo testů jsou omezené, protože neberou v úvahu komplexní působení na organismus člověka nebo zvířat. Další nevýhodou je absence metabolizmu, což může vést k ,,falešně negativní“ odpovědi. Mezi in vitro testy patří: test vazby ligandu na receptor, test proliferace buněk, test s reportérovými geny.




  1. Test vazby ligandu na receptor

Tyto testy slouží k detekci látek, které přímo interagují s endokrinním receptorem (např. estrogenní receptor nebo androgenní receptor). Receptorové testy měří afinitu receptoru pro vybrané ligandy. Testy jsou založeny na kompetici mezi neradioaktivní sloučeninou a radioaktivně označeným přirozeným hormonem při vazbě na receptor. Nevýhodou je, že neposkytují informace týkající se hormonální činnosti, a tak se nedají určovat jestli má agonistické či antagonistické účinky.

  1. Test proliferace buněk

E-sreen test je nejznámější příklad tohoto typy testu. Je založen na buněčných liniích pocházejících z lidského karcinomu prsu (MCF-7). Buňky proliferují v reakci na estrogeny nebo estrogenně aktivní látky. Díky vysoké citlivosti buněk na estrogeny, E-sreening je jednou z nejcitlivějších testů analyzující estrogenitu sloučenin. Tento test je vhodný k rozlišení mezi estrogenním agonistou nebo antagonistou. Jeho nevýhodou je nedostatek specifiky pro estrogen, protože buňky proliferují v odpovědi na spousta dalších látek (cytokiny, růstové faktory), proto je test obtížné použít na enviromentální vzorky obsahující toxické složky.

  1. Test s reportérovými geny

Principem reportérových testů genové exprese je měřit indukci genové transkripce po aktivaci receptoru. Tyto testy používájí savčí buněčné linie nebo kmeny kvasinek, které jsou přeneseny reportérovým plasmidem. Plasmid se skládá z hormonálního responsivního elementu k němuž je připojen reportérový gen, jako β -galaktosidáza nebo luciferáza. Kmeny kvasinek obsahují další expresní geny, které kódují konkrétní hormonální receptor. Expozice hormonálně aktivní sloučenině povede k vazbě této sloučeniny s receptorem. Komplex ligand-receptor tvoří dimer, které se vzájemně ovlivňují s HRE což vede k aktivaci transkripce exprese genu β-galaktosidáza. β-galaktosidaza metabolizuje substrát a vytváří červenou barvu, která může být detekována spektrofotometrem.
In vivo testy

In vitro testy je třeba rozšířit o provádění celkového testování a to na laboratorních zvířatech. In vitro testy měří pouze jednu specifickou charakteristiku. In vivo testy byly navrženy k plnému porozumění působení EDC na celý organismus. Multi-generační reprodukční studie jsou nejtěžší zkouškou pro identifikaci nežádoucích účinků. Výsledky těchto testů mohou být použity pro hodnocení rizika i pro člověka. Testy se provádějí např. na hlodavcích nebo rybách.


Vhodnými testy může být použití biosensorů. Této problematice je věnována následující kapitola.


  1. Biosenzory pro detekci endokrinních disruptorů

Celá tato kapitola vychází z těchto zdrojů: [Rodriguez-Mozaz et al., 2003], [Rodriguez-Mozaz et al., 2004], [Rodriguez-Mozaz et al., 2006]. Proto následující odstavce nejsou dále citovány.

V následující kapitole budou popsány biosenzory vyvinuté pro monitorování životního prostředí. Jsou vhodné k hodnocení ekologické/biologické kvality prostředí nebo k detekci anorganických a organických polutantů. Polutanty jsou obvykle rozděleny do dvou skupin: podle chemické struktury nebo podle způsobu jejich působení (akce). Příkladem akcí jsou endokrinní disrupce, cytotoxicita, karcinogenita, mutagenita nebo genotoxicita. Prvním typem jsou biosenzory měřící efekt (toxicita a endokrinní disrupce), a druhým typem jsou ty, které detekují sloučeniny nebo skupiny sloučenin založené na specifické rozpoznávací biomolekule.




    1. Toxicita a genotoxicita

V současnosti jsou k monitorování polutantů v životním prostředí využívány chemické analytické metody. Chemická analýza ale neposkytuje dostatečné informace pro posouzení ekologického rizika znečištěných vod a odpadních vod, protože na základě koncentrace analyzovaných látek se jejich účinky (synergické, antagonistické účinky) nedají odhadnout. Účinky látek můžou být zhodnocen, ale musí k tomu být využita biologická složka. Stanovení toxicity poskytuje ucelený obraz o celkovém dopadu na životní prostředí, které může být produkováno odpadními vodami, sedimentem nebo i půdou z kontaminovaných míst. V Evropské unii společně s přísnějšími požadavky na úpravu vody(průmyslové a městské odpadní vody) musí dosáhnout určité meze netoxicity před vypuštěním odpadních vod do životního prostředí. Tudíž v posledních letech bylo vynaloženo spousta úsilí na rozvoj a užívání různých biotestů a biosenzorů pro hodnocení toxicity vzorků vody.


Celé organismy se používají k měření potenciálního biologického dopadu (toxicity) ze vzorku půdy nebo vody. Tak je tomu v případě testu toxicity u Microtox nebo ToxAlert. K měření toxicity ve vzorcích tyto systémy využívají luminiscenční bakterii (Vibrio fischeri). Bakteriální bioluminiscense se ukázala být vhodným měřítkem buněčného metabolismu, a tedy spolehlivým snímačem k měření toxických látek ve vzorcích. Některé metody biotestů jsou integrovány i v biosenzorech jako Cellsense. Je to amperometrický biosensor, který obsahuje bakteriální buňky Escheria coli vhodné pro rychlou analýzu ekotoxicity. Používá ferikyanin (mediátor), který odkloňuje elektrony z dýchacího systému imobilizovaných bakterií na vhodné uhlíkové elektrody. Výsledný proud je míra bakteriální respirační aktivity a odchylky způsobené přítomností polutanů jsou detekovány jako změna velikosti proudu. Cellsense byla uplatněna k zjišťování toxicity 3,5-dichlorfenol a jiných fenolů v odpadních vodách, pro stanovení neiontově povrchově aktivních látek a benzen-sulfonátových sloučenin, pro testování toxicity odpadních vod a čistírenských kalů.

Většina enviromentálních biosenzorů se zaměřila na bakteriální systém, zatímco biosenzory na eukariotických buňkách jsou vzácné, jěště vzácnější je použití savčích buněk. Savčí buňky, což je složitější komplex než bakterie, může dávat citlivější odpověď ve srovnání s bakteriemi a zároveň reagovat na chemické látky s estrogenními účinky.


Multikanálový dvoustupňový mini-bioreaktor používá geneticky modifikované bioluminiscenční bakterie ke stanovení toxicity některých EDC a sloučenin citlivých na superoxidy. Ostatní rekombinantní organismy, které reagují citlivě na širokou škálu chemických látek, byly vyvinuty k využití jako biosensory mikrobiální toxicity. V nedávné práci Lee et al.,(2005) prezentoval řadu buněčných technologií, které využívají 20 rekombinantních bioluminscentních bakterií k detekci a klasifikaci enviromentální toxicity. [Rodriguez-Mozaz et al., 2006]

Senzory pro ostatní oblasti ekotoxikologie, jako je genotoxicita a mutagenita, byly také vyvinuty. Tyto biosenzory jsou často založeny na interakci se sloučeninami s nukleovými kyselinami nebo geneticky modifikovanými mikroorganismy, které jsou navrženy tak, aby reagovaly na stres jako je toxicita. Genotoxicita je spojována s různými sloučeninami jako jsou fenoly, chlorfenoly, PCB a PAH a představuje včasně varující parametr pro možnost vzniku rakoviny. Během posledních let rekombinantní technologie vytvořily novou luminiscenční bakterie pro použití v různých testech toxicity a genotoxicity. Příkladem toho je biosensor založený na zeleném fluorescentním proteinu k detekci aktivity genotoxických látek využívající rekombinantní kmeny bakterie Escherichia coli.




    1. Endokrinní efekt

Endokrinní disruptory je třída látek, které nejsou definovány svým účinkem, ale svým biologickým efektem. Interferují s endogenním hormonálním systémem a spousta z nich se váže na ER jako agonista nebo antagonista. Vazebná schopnost chemických látek k ER může být měřena pomocí biosenzorů založených na těchto přírodních receptorech za účelem testování jejich potenciálního dopadu na životní prostředí. Jejich výhodou je, že mohou být identifikovány všechny endokrinní disruptory, které působí prostřednictvím příslušného receptoru. Tyto biosenzory představují podobný princip, jako byl popsán výše pro toxicitu. Jsou sledovány účinky jako obecný parametr, nikoli konkrétní látka. Pomocí běžně užívaných lidských ER, které SPR biosenzor BIAcore použil při stanovení estrogenů a xenoestrogenů a ve studii vazby cílových látek. Ostatní optické biosenzory založené na rekombinantních buňkách (optické, elektrochemické a piezoelektrické biosenzory) jsou také založeny na estrogenním receptoru. Senzory uvedené výše jsou určeny pro detekci interakce řady různých chemických látek s ER.


    1. Biosenzory pro specifické EDC


Hormony

Koncentrace endogenních hormonů vyskytujících se v životním prostředí se časem zvyšuje a to z důvodu rostoucí populace a intenzivnějšího zemědělství. Ačkoliv se tyto látky nacházejí ve vodách ve velmi nízkých koncentracích, vědci upozornili na to, že i tyto koncentrace jsou potenciálně nebezpečné zvláště pro vodní živočichy. [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]

Některé biologické techniky (většinou imunotesty) byly použity k analýze steroidů ve vodě. Použití optického imunosenzoru pro stanovení estronu a dalších org. látek (atrazin, isoproturon) v reálných vzorcích vody popsal Rodriguez-Mozaz et al.(2004). Evropská unie financuje rozvoj nových optických metod. Jako příklad je výzkum zabývající se vývojem sensoru pro rychlou detekci androgenních reziduí ve zvířatech. RADAR, skupina výzkumníků, vyvíjí afinitní senzor pro jeden a více analytů a senzory založené na receptorech k rychlé detekci androgenů (jako testosteron a metabolity). [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]
PCB

PCB jsou hojně využívané jako průmyslové chemické látky (dielektrické kapaliny v elektrických transformátorech a kondenzátorech). Mají vysoký biakumulační potenciál, a proto představují riziko pro širokou veřejnost. Byla zkoumána jejich estrogenita a antiestrogenita.[ Rodriguez-Mozaz et al., 2003] DNA biosenzor s detekcí potenciometrickou a další imunosenzory s fluorescenčním, SPR, a elektrochemickým detekčním systémem. Imunosenzor s fluorescenční detekcí byl použit k určení obsahu PCB v řece.


Dioxiny

Dalšími obávanými sloučeninami jsou dioxiny. Na rozdíl od PCB, dioxiny jsou látky, které jsou vedlejšími produkty při výrobních procesech zahrnující chloraci (produkce pesticidů, výroba PVC, bělení papíru). Jsou považovány za karcinogenní a nedávno byly zahrnuty mezi potencionální EDC. Klasická analýza dioxinů zahrnuje pracné vícestupňové postupy, které zvyšují náklady na analýzu. Značný počet imunotestů pro dioxiny byl vyvinut ve snaze poskytnout jednodušší a rutinní analýzu. Shimomura et al. (2001) použili SPR biosenzor (BIAcore 2000) v kombinaci s imunotesty pro detekci tří EDC (dioxin (2,3,7,8-TCDD), 3,3′,4,4′,5-penthachlorobifenyl (PCB), atrazín). [Rodriguez-Mozaz et al., 2004] Podobně i další biosenzory k detekci dioxinů (furan, bifenyl), jsou založeny na rekombinantních buněčných liniích, což bylo charakterizováno a optimalizováno Pasini et al. (2002). [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]


Fenoly

Fenolické sloučeniny jsou často produkovány při výrobě barviv, papíru a celulózy. Vzhledem k vysoké toxicitě a možné akumulaci jsou za významné znečišťovatele považovány jejich chlorované deriváty. Parellada et al.(1998) vyvinuli ampérometrický biosenzor s tyrosinázou imobilizovanou v higrogelu na uhlíkové elektrodě. [Rodriguez-Mozaz et al., 2006] Chlorfenoly byly rovněž detekovány pomocí optických biosenzorů na základě chemiluminiscence, která využívá schopnosti některých substituovaných fenolů zvyšujících chemiluminiscenční reakci luminolu (katalyzována peroxidázou).


Povrchově aktivní látky

Z povrchově aktivních látek jsou nerozšířenější aniontové a to zejména sulfonáty. Reshetilov et al. (1997) a Taranova et al. (2002) studovali citlivost a selektivitu biosenzorů, založených na bakteriálních kmenech Pseudomonas a Achromobavter. Degradace povrchově aktivních látek bakteriemi způsobuje pokles v koncentraci rozpuštěného kyslíku a tím změnu proudu na kyslíkové elektrodě. Alkylfenol ethoxylát (APEO) patří do skupiny neiontových surfaktantů a je používán v různých průmyslových aplikacích, jako je výroba papíru, barev, plastů, latexu, pryže, atd. APEO nesjou zařazeny mezi vysoce toxické látky, ale jejich metabolity (alkylfenoly AP, karboxylové deriváty APEC), které narušují endokrinní systém. Proto jejich detekce má velký význam. Rose et al. (2002) popsal vývoj kapilárního imunotestu pro APEO a AP s využitím biosenzoru založeném na dehydrogenáze glukózy (DH). [Rodriguez-Mozaz et al., 2003]


PAH

PAH jsou hojně rozšířené znečišťující látky obecně vznikající během nedokonalého spalování nebo pyrolýzy uhlovodíků. Řada z nich jsou uznány jako karcinogenní látky a některé i jako endokrinní disruptory. Můžou reagovat jako antiestrogeny, a tak blokovat aktivaci estrogenního receptoru a nebo se vázat na AhR , což vede k širokému spektru antiestrogenních odpovědí. Amperometrický biosenzor pro naftalén nalezen v půdě byl konstruován s použitím Sphingomonas yanoikuyae . [Rodriguez-Mozaz et al., 2003] Byly vyvinuty i fluorooptické imunosenzory (s laserovým buzením) pro benzo(a)pyren (BaP) další adukty. Dopad laseru na snímač derektoru způsobí u BaP vázaného na optická vlákna detektoru excitaci a následně je detekována fluorescence.


Pesticidy

Nejvíce rozšířené biosenzory pro stanovení pesticidů jsou enzymatické biosenzory založené na inhibici určitého enzymu. Různé biosenzory, detekující organofosfáty nebo karbamátové sloučeniny (insekticidy), byly vyvinuty na základě inhibice acetylcholinesterázy a colin oxidázy. Optické biosenzory používají tyto enzymy jako biosnímací prvek což popsal Choi et al. (2001). Je založen na konverzi substrátu o-nitrofenol-acetát na o-nitrofenol (žlutý produkt). Další typ popisuje Andreou et al. (2002) a Andres a Narayanaswamy (1997), kde se barva indikátoru změní v závislosti na pH, které je změněno působením enzymu. Citlivé biosenzory založené na inhibici AChE nejsou selektivní, neboť AChE je inhibována obecně neurotoxiny, organofosfátovými a karbamátovými pesticidy a mnoha dalšími sloučeninami. Co se týče použití protilátek jako rozpoznávací jednotky, Wilmer et al. (1997) vyvinul amperometrický imunosenzor založen na inhibici alkalické fosfatázy pro detekci

2,4-dichlorofenoxyacetátové kyseliny ve vodě. [Rodriguez-Mozaz et al., 2003]
Kovy

Stanovování těžkých kovů v životním prostředí je velmi důležité, protože jsou velmi toxické a bylo zjištěny i vlastnosti endokrinních disruptorů.[Iavicoli et al., 2009] Kovy se můžou detekovat pomocí analytických metod (iontová chromatografie, polarografie), které dokážou určit pouze přítomnost kovu, ale ne jeho toxické účinky. Jednou z výhod celo buněčných senzorů je schopnost reakce již na malé množství kovu. K nedávnému pokroku došlo ve vývoji biosenzorů používajících bakteriální buňky k monitorování toxických kovů. Těžké kovy inhibují aktivitu enzymů. Uplatnění tohoto jevu nabízí hned několik výhod, jako je jednoduchost a citlivost. Krawczynski vel Krawczyk et al. (2000) studoval inhibiční účinek rtuti a dalších iontů těžkých kovů na hydrolýzu ureázy katalyzovanou ureázou imobilizovanou v PVC vrstvě na povrchu elektrody. Protože tato metoda není specifická, byla použita pro určení celkového inhibičního účinku způsobeného těžkými kovy ve vzorcích vody.

Další biosenzory jsou založeny na proteinech. V těchto případech biosenzor monitoruje konformační změny způsobené vazbou kovových iontů na bílkoviny. Bontidean et al. (2000) jako biorekogniční element použil bílkovinu, která na sebe váže iont rtuti. Konfirmační změny způsobí změnu v kapacitě, která je přímo úměrná koncentraci kovu stanovovaných iontů. [Rodriguez-Mozaz et al., 2004]
Tab. 4 Příklady biosenzorů pro stanovení EDC a toxicity

[Rodriguez-Mozaz et al., 2003], [Rodriguez-Mozaz et al., 2004], [Rodriguez-Mozaz et al., 2006]




Převodník

Biorekogniční složka

Enviromentálně významné sloučeniny nebo efekty

Optický (bioluminiscence)

Rekombinantní bioluminiscenční bakterie

Toxicita




Geneticky modifikované bioluminiscenční bakterie

Toxicita

Elektrochemický (amperometrický)

Escherichia coli

Toxicita




Rekombinantní bakterie E. coli

Genotoxicita

Optický (fluorescenční mikroskopie)

Rekombinantní kvasinky

EDC

Optický (SPR)

Estrogenní receptor

EDC

Elektrochemický (cyklická voltametrie)

Estrogenní receptor

EDC

Elektrochemický (amprometrický)

protilátka

Atrazin




protilátka

Surfaktanty (alkylfeno la a jeho ethoxyláty)




protilátka

Estradiol




enzym (AChE)

Paradoxon a karbofuran (pesticidy)




enzym (tyrosinasa)

Fenoly, EDC




Fotosystém II (PSII)

Diuron, atrazin,simazin




bakterie Pseudomonas a achromobacter

Surfaktanty

Optická chemiluminiscence (optické vlákno)

Enzym (křenová peroxidáza)

chlorfenol

Optický (fluorescence)

Cholera vulgarit (buňky řas)

Isoproturon, diuron, simazin

Optický

Protilátky

Pesticidy a estrony

Optický (bioluminiscence)

E. coli (luciferázový gen světlušky)

Zn, dichroman, chroman




E. coli (mer-lux gen)

Hg




  1. Závěry

Předkládaná bakalářská práce se věnuje biosenzorům, a možnostem jejich využití při sledování endokrinně aktivních látek . Byly stručně popsány principy a funkce biosenzorů a jednotlivé typy biosenzorů. Dílčí kapitola seznamuje s problematikou endokrinních disruptorů, popisuje jejich účinky a konkrétní látky vykazující tyto účinky.

Následně byly vypracovány přehledy biosenzorů, které slouží k monitorování životního prostředí. Z komerčních biosenzorů je nejvíce využíván optický biosenzor BIAcore založen na povrchové plasmonové rezonanci (SPR). V případě biorekogničního elementu je v literatuře nejvíce zmiňován biosenzor s protilátkou a s bakteriálním efektem.

Ačkoliv je v environmentální praxi využití biosenzorů spíše omezené, jedná se o perspektivní vědecký obor, který je rozvíjen na řadě pracovišť světa. S ohledem na detekci endokrinních disruptorů lze jako biorekogniční element využít interakce sledovaných látek s receptory (např. ER, AR apod.) a využít toho při případném vývoji nových typů biosenzorů.

Anotace

Řada látek přítomných ve složkách životního prostředí působí na hormonální systém organismů různými mechanismy. Kromě chemické analýzy se ke zjištění přítomnosti těchto látek v enviromentálních matricích používají také nejrůznější biotesty pro zjištění anti/estrogenního nebo anti/androgenního potenciálu vzorků z prostředí. Za specifický typ biotestů lze považovat i biosenzory, tedy analytická zařízení obsahující biologickou součást (enzym, imobilizované buňky apod.). Cílem této bakalářské práce je připravit literární přehled o biosenzorech a jejich potenciálním využití při hodnocení endokrinní disrupce. V dílčích částech práce jsou diskutovány principy konstrukce senzorů, problematika endokrinních disruptorů a možnosti spojení obou oblastí v analýze životního prostředí.


Klíčová slova: biosenzory, endokrinní disruptory, endokrinní efekt, androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ER)


Annotation

Many substances present in the enviromental affect hormonal system of organisms by different mechanisms. Beside chemical analysis for detection of specific substances, variety of bioassays for detection anti/estrogenic or anti/androgenic potencial of samples have been designed and used. Specific type of bioassays can be biosensors, i.e. analytical devices containing a biological part (enzyme, immobilized cells, etc.). The aims of this bachelor`s thesis has been to prepare a literature overview of the biosensors and their potential use for assessment of endocrine disruptors. Specific chapters of the thesis describe principles of biosensors, problem of endocrine disruption as well as possible applications of sensors in the environmental analytics.


Key words: biosensors, endocrine disruptors, endocrine effect, androgenic receptor (AR), estrogenic receptor (ER)

Seznam použité literatury:

Bidmanová, Š. (2007): Development and Construction of Biosensors for Detection of Halogenated Compounds in the Environment. Masarykova univerzita, Brno. 79 s. Vedoucí práce Doc. Mgr. Jiří Damborský, Dr. Dostupné na WWW: http://is.muni.cz .

Connolly, L., Ropstad, E., Verhaegen, S. (2011): In vitro bioassays for the study of endocrine-disrupting food additives and contaminants. TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY 30, 227-238.

Eertmans, F., Dhooge, W., Stuyvaert, S., Comhaire, F. (2003): Endocrine disruptors: effects on male fertility and screening tools for their assessment. TOXICOLOGY IN VITRO 17, 515-524.

Giesy, J.P., Hilscherova, K., Jones, P.D., Kajman, K., Machala, M.(2002): Cell bioassays for detection of aryl hydrocarbon (AhR) and estrogen receptor (ER) mediated activity in environmental symplex. MARINE POLLUTION BULLETIN 45, 3–16.

Grund, S., Higley, E., Schonenberger, R., Suter, M. J. F., Giesy, J. P., Braunbeck, T., Hecker, M., Hollert, H. (2011): The endocrine disrupting potential of sediments from the Upper Danube River (Germany) as revealed by in vitro bioassays and chemical analysis. ENVIRONMENTAL SCIENCE AND POLLUTION RESEARCH 18, 446-460.   

Habauzit, D., Chopineau, J., Roig, B. (2007): SPR-based biosensors: a tool for biodetection of hormonal compounds. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 387, 1215-1223.

Iavicoli, I., Fontana, L., Bergamaschi, A. (2009): The Effects of Metals as Endocrine Disruptors. JOURNAL OF TOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL HEALTH 12, 206-223.

Kelce, W. R., Wilson, E.M. (1997): Environmental antiandrogens: Developmental effects, molecular mechanisms, and clinical implications., JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE-JMM 75, 198-207.

Lintelmann, J., Katayama, A., Kurihara, N., Shore, L., Wenzel, A. (2003): Endocrine disruptors in the environment (IUPAC Technical Report). *. PURE AND APPLIED CHEMISTRY 75, 631-681.

Macíková, P. (2007): Endokrinní disruptory detekované v in vitro systémy v různých složkách prostředí: bakalářská práce. Masarykova univerzita, Brno. 75 s. Vedoucí práce Mgr. Klára Hilscherová, PhD. Dostupné na WWW: http://is.muni.cz .

Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. (2011): The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. ECOTOXICOLOGY 20, 305-319.

Rodriguez-Mozaz, S., de Alda, M.J.L., Barcelo, D. (2006): Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 386, 1025-1041.

Rodriguez-Mozaz, S., de Alda, M.J.L., Marco, M.P., Barcelo, D. (2005): Biosensors for environmental monitoring - A global perspektive. TALANTA 65, 291-297.

Rodriguez-Mozaz, S., de Alda, M.J.L., Marco, M.P., Barcelo, D. (2004): Biosensors for environmental applications:Future development trends*. PURE AND APPLIED CHEMISTRY 76,723-752.

Rodriguez-Mozaz, S., de Alda, M.J.L., Marco, M.P., Barcelo, D. (2003): Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a review artikle. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 378, 588–598.

Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. (2004): In-vitro assays for determination of oestrogenic aktivity. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 378, 576-581.

Singleton, D. W., Khan, S. A. (2003): Xenoestrogen Exposure and Mechanisms of Endocrine Disruption.FRONTIERS IN BIOSCIENCE 8, 110-118.

Skládal, P. (2002): Biosenzor., Masarykova univerzita, Brno. Dostupné na WWW: http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdf .

Skládal, P., Macholán, L. (1997): Biosenzory-současný stav a perspektivy. CHEMICKÉ LISTY 91, 105 – 113.

Stroben, E., Oehlmann, J. and Fioroni, P. (1992). The Morphological Expression of Imposex in Hinia-Reticulata (Gastropoda, Buccinidae) - a Potential Indicator of Tributyltin Pollution. Marine Biology 113, 625-636.

Thevenot D. R., Toth, K., Durst, R.A., Wilson, G.S. (1999): Electrochemical biosensors: recommended definitions and classafication (Technical Report). PURE AND APPLIED CHEMISTRY 71, 2333-2348.

Truman, P.S., van den Hurk, P. (2010): Xenoestrogen Exposure and Effects in Bluegill from the Reedy River, South Carolina, USA. ARCHIVES OF ENVIRONMENTAL CONTAMINATION AND TOXICOLOGY 58, 165-175.
Andreou, V. G., Clonis, Y.D. (2002): Biosens Bioelectron 17, 61–69

Andres, R.T., Narayanaswamy, R. (1997): Talanta 44, 1335–1352

Bontidean, I., Lloyd, J. R., Hobman, J. L., Wilson, J. R., Csoregi, E., Mattiasson, B., Brown. N. L. (2000): J.Inorg. Biochem. 79, 225–229

Choi, J-W., Kim, Y-K., Lee, I-H, Min, J., Lee, W. H. (2001): Biosens Bioelectron 16, 937-943

Kleniv, A., Zaborosch, C., Spener, F. (1997): Gottlieb, J. et al. (eds) Field screening Europe. Kluwer, The Netherlands, pp 203–206

Krawczynski vel Krawczyk, T., Moszczynska, M., Trojanowicz, M. (2000): Biosens. Bioelectron. 15, 681–691

Lee JH, Mitchell RJ, Kim BC, Cullen DC, Gu MB (2005): Biosens Bioelectron 21, 500-507

Parellada, J., Narvaez, A., Polez, M. A. , Dominguez,E., Fernandez, J.J., Pavlov, V., Katakis, I. (1998): Anal Chim Acta 362, 47–57

Pasini, P., Gentlilomi, G., Baraldini, M., Musiani, M. , Roda, A. (2002): 12th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminiscence.

Reshetilov, A. N., Semenchuk, I.N. , Iliasov, P.V. , Taranova, L.A. (1997): Anal Chim Acta 347, 19–26

Rose, A., Nistor, C., Emneus, J., Pfeiffer, D, Wollenberger, U. (2002): Biosens Bioelectron 17, 1033–1043

Shimomura, M., Nomura, Y., Zhang, W., Sakino, M., Lee, K.-H., Ikebukuro, K., Karube, I. (2001): Anal. Chim. Acta 434, 223–230.

Taranova, L., Semenchuk, I., Manolov, T., Iliasov, P., Reshetilov, A. (2002): Biosens Bioelectron 17, 635–640

Wolker, M., Trau, D., Renneberg, R., Spener, F. (1997): Anal Lett 30, 515–525


Elektronické zdroje (všechny citovány leden-březen 2011):
Duft, M., Schulte-Oehlmann, U., Tillmann, M., Weltje, L., Oehlmann, J. (2004): Marine pollution of organotin compounds and their biological impact. LAND BASE [online]. Dostupné na WWW: http://landbase.hq.unu.edu/Workshops/IwateFeb2004/AbstractsFeb2004.htm#Duft

Kotzian, P. (2007): ELEKTROCHEMICKÉ BIOSENZORY [online]. Dostupné na WWW: http://www.peta.unas.cz/biosenzory/index.htm

1Noh, J., Moon, H. S., Kim, W., Park, S. (2010): Biosensor. MEDICAL ELECTRONICS LABORATORY [online]. Dostupné na WWW: http://melab.snu.ac.kr/melab/doku.php?id=research:research.in.melab:biosensor#members

2Rogers, K. R., Mascini, M. (2009): Biosensors for Analytical Monitoring. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY [online]. Dostupné na WWW: http://www.epa.gov/heasd/edrb/biochem/intro.html


ARNIKA [online]. Dostupné na WWW: http://arnika.org/chemicke-latky/chlordekon

Center for Medical and Urological Andrology – Gent [online]. Dostupné na WWW: http://andrology.endores.com/life98/technical.php

E.HORMONE [online]. Dostupné na WWW: http://e.hormone.tulane.edu/aboutUs.html

EM COM [online]. Dostupné na WWW: http://www.emcom.ca/welcome/index.shtml




1 http://melab.snu.ac.kr/melab/doku.php?id=research:research.in.melab:biosensor#members, březen 2011

2 http://melab.snu.ac.kr/melab/doku.php?id=research:research.in.melab:biosensor#members, březen 2011

3 http://nanohub.org/resources/2261/download/nanobiotechnology%20and%20biosensors.pdf, květen 2011

4http://www.cse.unt.edu/~smohanty/research/JournalPapers/2006/MohantyIEEEPotentials2006Biosensors.pdf


5 http://www.emcom.ca/EM/nature.shtml#

6 http://www.greenfacts.org/en/endocrine-disruptors/endocrine-disruptors.htm#2

7 http://andrology.endores.com/life98/technical.php , květen 2011

8 http://arnika.org/chemicke-latky/chlordekon



Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©atelim.com 2016
rəhbərliyinə müraciət