LISADO DE CÉLULAS
IMPORTANTE: TODO EN HIELO
A- Para células en suspensión o tripsinizadas
1-Añadir al Buffer de lisis, cóctel de inhibidor de proteasas , en proporción
1 pastilla / 50 ml de Buffer de lisis. Buffer de lisis, depende del ensayo.
* El buffer de lisis sin cóctel inhibidor de proteasas , se conserva a 4ºC en nevera. (Ripa , Tritón …)
-
Centrifugar los eppendorf con las células a 4500 rpm , 4ºC , 5 minutos .
-
Aspirar sobrenadante y resuspender pellet de células en Buffer de lisis (la cantidad de buffer de lisis dependerá de la cantidad de pellet obtenido).
-
Si el buffer de lisis es RIPA, pre-enfriar a -20ºC 5 minutos antes de resuspender el pellet y ser muy cuidadosos que los eppendorf estén siempre a 4ºC o menos para evitar la coalescencia del DNA genómico (“moco”).
-
Dejar en hielo 10 minutos.
-
Centrifugar a 4ºC , a max rpm (normalmente 14,000 rpm), 15 minutos
-
Preparar eppendorf nuevos y ponerlos en hielo, para echar sobrenadante después de la centrifugación, evitando coger el pellet.
B- Para células adherentes.
-
Igual a paso 1 de protocolo A
-
Aspirar medio de cultivo de la placa
-
Añadir aproximadamente buffer de lisis
-
Estimación: 200 ul para un pocillo de p6, 1000 ul para una p10.
-
Rascar con un scraper , haciendo un círculo y luego arrastrando las células hacia la parte de abajo de la placa.
-
Se recuperan las células resuspendidas de la placa en tubos eppendorf
A partir de este punto se continúan con los pasos 4, 5 y 6 del protocolo A. |
Yüklə 25.5 Kb.