Карапетьян ольга шаваршевна биомаркерная оценка состояния популяции бычка-кругляка neogobius melanostomus

Анализ полученных в 2010-2011 гг. данных показал, что значения активности ГSТ в печени бычка-кругляка не превышали результаты прошлых лет, полученные для данного вида рыб (Карапетьян и др., 2011).

В сентябре 2010 г. не было обнаружено достоверных различий активности ГSТ в печени рыб двух районов исследования: с. Весело-Вознесеновка и Таганрогского порта. Активность ГSТ в печени бычков у побережья Таманского залива в 2010 г. была достоверно ниже значений, полученных в Таганрогском порту (таблица 9).

В акваториях у побережья Таганрогского морского порта, ст. Должанской и к. Долгой показатели активности ГSТ в печени рыб достоверно не отличались друг от друга. Достоверных различий не было обнаружено и среди показателей бычков, отловленных в районах с. Весело-Вознесеновка, п. Ачуево и в Таманском заливе. Наибольшие значения активности ГSТ в 2010-2011 гг. были в печени бычков, обитающих в акватории Таганрогского порта.

Активность ГSТ в печени бычка-кругляка в 2010 и 2011 гг.

У самок IV, IV-V стадии зрелости (таблица 7) была выявлена отрицательная корреляционная зависимость активности ГSТ печени от величины гонадосоматического индекса. Данные корреляционного анализа позволяют предположить, что существует определенное влияние репродуктивного статуса рыбы на активность ГSТ печени. В литературе есть сведения, согласно которым воздействие 17-β-эстрадиола может значительно снижать активность ГSТ (Mdegela et al., 2006).

Корреляционный анализ активности ГSТ с уровнями токсикантов в тканях самцов бычка-кругляка выявил наличие положительной корреляции между активностью ГSТ и концентрацией ХОП в печени (r_S=0,81, p<0.05).

Большое количество работ посвящено исследованию влияния ХОП на активность ГSТ в печени разных видов рыб (Rodriguez-Ariza et al., 1994; Gadagbui, Goksoyr, 1996; Van der Oost et al, 2003). В них приводятся экспериментальные данные, подтверждающие увеличение активности фермента в ответ на воздействие персистентных ксенобиотиков данного класса.

В процессе обработки данных была обнаружена положительная связь между уровнем свинца в печени и в мышцах рыб и активностью ГSТ в печени (таблица 10).

Высокая активность ГSТ в печени бычков Таганрогского порта наблюдалась на фоне высоких концентраций указанных токсикантов в печени и мышцах рыб.

Значения коэффициентов корреляции между уровнем свинца в организме самцов бычка-кругляка с активностью ГSТ в печени рыб в 2010-2011 гг. (p<0.05)

Участие ГSТ в элиминации последствий воздействия металл-индуцированного окислительного стресса было показано у многих видов рыб (Борвинская и др., 2009). В других исследованиях была показана способность свинца вызывать значительное повышение активности ГSТ в печени (Barata et al., 2005).

Исходя из данных литературы, можно предположить, что увеличение активности глутатион-S-трансферазы в печени бычка-кругляка при воздействии тяжелых металлов происходит вследствие интенсификации свободнорадикальных процессов в организме рыб и опосредованной этим индукции генов фермента.

Таким образом, использование активности глутатион-S-трансферазы печени бычка-кругляка в качестве биомаркера показало степень реагирования ферментов второй фазы детоксикации на воздействие таких поллютантов как ХОП и свинец. Повышение активности ГSТ в ответ на действие данных токсикантов (в особенности в печени бычков Таганрогского порта в 2010-2011 гг.) может свидетельствовать о том, что организм бычка-кругляка адаптируется к обитанию в загрязненной среде. Адаптация достигается за счет более высокой активности ферментных систем, которые выводят вредные вещества из тканей и нейтрализуют неблагоприятные эффекты, вызванные их воздействием.

При исследовании уровня ГSH в печени бычка-кругляка в 2010-2011 гг. были выявлены значительные колебания этого показателя.

В 2010 г. содержание восстановленного глутатиона в печени самцов II стадии зрелости, отловленных из района порта г. Таганрога и у с. Весело-Вознесеновка, достоверно не отличались друг от друга и колебались в пределах 35,34 – 37,24 мкг/мг белка фракции S9. У бычков Таманского залива значения исследуемого показателя были выше в два раза (рис. 7).

Рис. 7. Средние концентрации восстановленного глутатиона в печени бычка-кругляка из разных прибрежных районов Азовского моря в 2010 г.
В 2011 г. средняя концентрация глутатиона в печени самцов варьировала от 24,85 мкг/мг (с. Весело-Вознесеновка) до 67,85 мкг/мг белка фракции S9 (ст. Камышеватская). Были выявлены достоверные различия между уровнем глутатиона в печени самцов и самок (рис. 8).

Уровень ГSH в печени самок IV, IV-V стадии зрелости гонад был максимальным и отрицательно коррелировал с массой гонад и ГСИ (r_S=-0,66, p<0.05). Учитывая тот факт, что нерест – это своеобразный стресс для организма, можно предположить, что в этот период в печени резко возрастает продукция восстановленного глутатиона, а затем глутатион транспортируется в развивающиеся гонады и предотвращает развитие свободнорадикальных процессов. В литературе имеются данные, подтверждающие это предположение на других видах рыб (Shulman, 1999; Filho et al., 2001; Гостюхина и др., 2010).

Корреляционный анализ выявил связь между уровнем глутатиона и концентрациями цинка и свинца в печени. Коэффициент корреляции Спирмана между уровнем глутатиона и Zn в печени самок составил -0,80, глутатионом и КДБА свинца в печени самок -0,90 (p<0.05). Коэффициент корреляции между уровнем глутатиона и КДБА свинца в печени самцов составил -0,74 (p<0.05).

Полученные корреляционные связи согласуются с литературными данными, так как известно, что восстановленный глутатион наряду с металлотионеинами является цитоплазматическим лигандом для катионов металлов (Di Giulio, 2008). Таким образом, обнаружение отрицательной корреляционной связи между уровнем глутатиона и накоплением ряда металлов в печени (в особенности у самок) подтверждает защитную роль глутатиона в период нереста рыб.

Наличие токсиканта в воде само по себе еще не означает токсичность. Токсические вещества должны быть биологически доступны, поскольку токсичность – характеристика биологическая. Бывают случаи, когда токсичность не может быть определена, а вода токсична. И наоборот, химический анализ показывает наличие токсикантов, а токсичность не проявляется (Флеров, 1989).

Комплексный подход, включающий использование разных методов анализа гидробионтов и среды их обитания, способен дать наиболее полную и адекватную оценку состояния водных экосистем, а также прогнозировать последствия кратковременного и долговременного антропогенного воздействия на качество среды и пригодность ее для нормальной жизнедеятельности гидробионтов (Руднева и др., 2004).

Многосторонний эколого-биохимический анализ функционального состояния бычка-кругляка из прибрежных районов Азовского моря с использованием маркеров биоаккумуляции, морфометрических и молекулярных биомаркеров позволил оценить отклик гидробионтов на неблагоприятное воздействие загрязнения.

Сравнение данных химического анализа воды и донных отложений с маркерами биоаккумуляции показало высокую способность печени бычка-кругляка к накоплению ксенобиотиков. Обнаружено, что данный вид рыб, являясь звеном трофических цепей собственно моря и заливов, обладает высокими биоаккумулятивными способностями, несмотря на сравнительно высокую активность ферментов биотрансформации. При этом маркеры биоаккумуляции (коэффициенты накопления и концентрации токсикантов в тканях) позволяют выявить взаимосвязь между ксенобиотическим составом среды обитания и химическим составом тканей рыб.

На рисунке 9 представлен предполагаемый механизм воздействия загрязнения приоритетными токсикантами на популяцию бычка-кругляка в прибрежных районах Азовского моря, составленный на основе результатов исследования.

Таким образом, несмотря на то, что корреляция морфометрических и молекулярных биомаркеров с маркерами биоаккумуляции в большинстве случаев отражала процессы адаптации вида к обитанию в условиях загрязнения, из схемы на рисунке 9 видно, что действие приоритетных токсикантов в прибрежных районах Азовского моря превосходит адаптационные возможности бычка-кругляка. Накопление неблагоприятных эффектов при действии ксенобиотиков на молекулярном уровне приводит к возникновению морфологических отклонений и к снижению репродуктивного потенциала особи. Нарушение репродуктивной функции отдельных особей в конечном итоге сказывается на воспроизводстве всей популяции и приводит к снижению эффективности размножения на популяционно-видовом уровне.

Важно отметить, что данное исследование подтверждает несовершенство принятых в настоящее время санитарно-эпидемиологических нормативов. Отсутствие превышения допустимых уровней по содержанию загрязняющих веществ в рыбе не может быть использовано в качестве доказательства благополучия рыбной популяции. Биоиндикационный поход с использованием биомаркеров вида-биоиндикатора позволяет более полно оценить эффекты загрязняющих веществ на гидробионтов и выявить негативное воздействие на рыбную популяцию даже при воздействии нормативных концентраций токсических веществ.

Токсиканты в воде и донных отложениях

Передача токсикантов по пищевой цепи





Биомагнификация

Биоаккумуляция токсикантов в теле бычка

Транспорт токсикантов

I фаза биотрансформации Цитохромы Р450 и b5

ХОП

II фаза биотрансформации

ГSТ


ГSH

ГSH и др. нефермент. антиоксидан-ты.

Рис. 9. Предполагаемый механизм воздействия загрязнения приоритетными токсикантами на популяцию бычка-кругляка в прибрежных районах Азовского моря.

1. Высокие значения маркеров биоаккумуляции в печени бычка-кругляка свидетельствуют о высокой биоаккумулятивной способности данного вида. В то же время химический состав тканей бычка-кругляка не вполне соответствует ксенобиотическому профилю среды его обитания. Это обусловлено частичной недоступностью ряда химических форм токсикантов среды для бычков, различной способностью токсикантов к миграции по пищевым цепям, видовыми особенностями процессов биотрансформации и выведения токсических веществ из организма рыб.

2. При увеличении стадии зрелости у самцов и самок бычка-кругляка происходит снижение величины коэффициента упитанности и гепатосоматического индекса, значения гонадосоматического индекса возрастают. Зависимость морфометрических показателей от репродуктивного статуса особи в наибольшей степени выражена у самок.

3. Снижение репродуктивного потенциала бычка-кругляка происходит при увеличении накопления персистентных ксенобиотиков в печени. Присутствие незрелых особей в нерестовом стаде и низкие значения коэффициента упитанности у бычков в районе п. Ачуево и Темрюкского порта связаны с накоплением нефтяных углеводородов и хлорорганических пестицидов в печени рыб. Низкие значения гепатосоматического индекса у самцов бычка-кругляка, отловленного в районах Таганрогского порта, ст. Должанской и к. Долгой в 2011 г. связаны с накоплением хлорорганических пестицидов в печени. Низкие значения гонадосоматического индекса у самцов IV стадии зрелости п. Ачуево и Темрюкского порта также обусловлены негативным влиянием накопления хлорорганических пестицидов.

4. Высокое содержание и активность ферментов системы биотрансформации у бычка-кругляка по сравнению с рыбами других видов (пиленгаса, осетра, камбалы-калкан, севрюги, судака), позволяют ему лучше адаптироваться к обитанию в условиях загрязнения за счет активного метаболизма и выведения ксенобиотиков.

5. Межгодовая динамика уровня микросомальных цитохромов и активности глутатион-S-трансферазы в печени бычка-кругляка Азовского моря характеризуется значительными колебаниями и зависит от изменений в ксенобиотическом профиле среды обитания рыб.

6. При увеличении гонадосоматического индекса у самок бычка-кругляка IV, IV-V стадии зрелости в печени происходит снижение содержания микросомальных цитохромов и активности глутатион-S-трансферазы. Снижение содержания цитохромов незначительное и нивелируется влиянием множества других факторов.

7. Существуют половые различия в содержании глутатиона в печени бычка-кругляка с разным репродуктивным статусом. Содержание восстановленного глутатиона у самок бычка-кругляка достоверно выше, чем у самцов. У самок уровень ГSH в печени возрастает с увеличением степени зрелости гонад. Предполагается, что глутатион печени самок IV-V стадии зрелости участвует в предотвращении развития свободнорадикальных процессов в гонадах. Снижение содержания восстановленного глутатиона в печени самок бычка-кругляка прибрежных районов Азовского моря обусловлено влиянием накопления Zn и Pb в печени.

8. Накопление нефтяных углеводородов и кадмия угнетает ферменты микросомальной гидроксилирующей системы печени бычков. Накопление кадмия в большей степени вызывает снижение микросомальных цитохромов в печени бычков Таманского залива и к. Долгой. Поступление хлорорганических пестицидов из воды и их накопление в печени, напротив, вызывает увеличение содержания цитохрома P450 в печени бычков районов с. Весело-Вознесеновка, Таганрогского порта, ст. Должанской и Темрюкского порта.

9. Высокая активность глутатион-S-трансферазы в печени рыб из района Таганрогского порта в 2010-2011 гг. является адаптационным ответом на комплексное воздействие хлорорганических пестицидов и свинца. Адаптация достигается за счет высокой активности фермента, который способствует более быстрому выведению вредных токсикантов из организма и нейтрализует неблагоприятные эффекты, вызванные их воздействием.

10. Совокупность использованных в исследовании морфометрических и молекулярных биомаркеров позволяет оценить эколого-биохимический статус и благополучие популяции бычка-кругляка в прибрежных районах Азовского моря. При этом необходимо учитывать внутривидовые особенности варьирования биомаркеров и их зависимость от репродуктивного статуса особи.

11. Действие приоритетных токсикантов в прибрежных районах Азовского моря превосходит адаптационные возможности бычка-кругляка. Накопление неблагоприятных эффектов при действии ксенобиотиков на молекулярном уровне приводит к возникновению морфологических отклонений и к снижению репродуктивного потенциала особи. Нарушение репродуктивной функции отдельных особей в конечном итоге сказывается на воспроизводстве всей популяции бычка-кругляка Азовского моря и приводит к снижению эффективности размножения на популяционно-видовом уровне.

12. Результаты исследований молекулярных и морфометрических биомаркеров бычка-кругляка доказывают возможность использования данного вида рыб в качестве биоиндикатора загрязнения Азовского моря.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список работ, опубликованных в изданиях из перечня ВАК:

1. Карапетьян О.Ш. Особенности функционирования микросомальной гидроксилирующей системы печени у некоторых рыб Азовского моря // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – Ростов-на-Дону, 2010. №4.   С. 89-91 (100%, 0,42 п.л.).

2. Карапетьян О.Ш., Цема Н.И., Дудкин С.И. Молекулярные биомаркеры антропогенного загрязнения в печени бычка-кругляка Neogobius melanosotomus из Таганрогского залива // Вопросы рыболовства. – Москва, 2011. Т. 12, №4 (48).   С. 747-759 (0,62 п.л., 60 %).

3. Карапетьян О.Ш., Павленко Л.Ф., Короткова Л.И., Кораблина И.В., Цема Н.И. Влияние накопления приоритетных токсикантов в печени бычка-кругляка Neogobius melanostomus Азовского моря на морфометрические и молекулярные биомаркеры данного вида рыб // Современные проблемы науки и образования: Электронный журнал. – Москва, 2012. № 1.   URL: http://www.science-education.ru/101-5429 (0,44 п.л., 60 %).

4. Карапетьян О.Ш., Дудкин С.И. Система микросомального окисления в печени рыб как показатель уровня антропогенного загрязнения Азовского моря // «Комплексные гидробиологические базы данных: ресурсы, технологии и использование»; «Адаптации гидробионтов»: Материалы молодежных школ. – Ростов-на-Дону, 2005.   С. 182-184 (0,16 п.л., 80 %).

5. Карапетьян О.Ш., Дудкин С.И. Биомониторинг загрязнения Азовского моря по показателям микросомального окисления в печени рыб // Материалы IX Съезда Гидробиологического общества РАН.   Тольятти, 2006. Т. I.   С. 143 (0,04 п.л., 80 %).

6. Карапетьян О.Ш. Ферменты первой фазы детоксикации у рыб как биомаркеры загрязнения водных экосистем // Сборник материалов 5-й всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: «Молодежь XXI века — будущее российской науки».   Ростов-на-Дону, 2007. Т. I.   С. 17-19 (0,16 п.л., 100 %).

7. Карапетьян О.Ш., Дудкин С.И. Физиологические и экотоксикологические аспекты изучения микросомальных монооксигеназ на примере рыб Азовского и Черного морей // Материалы международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем».   г. Ростов-на-Дону, 2006.   С. 166-169 (0,24 п.л., 80 %).

8.  Карапетьян О.Ш. Содержание цитохромов P-450 и b5 в печени бычка-кругляка Азовского моря как критерий оценки его физиологического состояния и условий среды обитания // Материалы международной научной конференции «Современное состояние водных биоресурсов и экосистем морских и пресноводных вод России: проблемы и пути решения».   г. Ростов-на-Дону, 2010.   С. 167-168 (0,16 п.л., 100 %).

9. Карапетьян О.Ш., Дудкин С.И., Внуков В.В. Микросомальные цитохромы печени бычков Азовского моря как биомаркеры степени загрязнения водной среды // Современные наукоемкие технологии. – Москва, 2010. № 7.   С. 182-183 (0,04 п.л., 70%).

10. Карапетьян О.Ш. Активность глутатион-S-трансферазы в печени бычка-кругляка Азовского моря в условиях хронического загрязнения // Тезисы VII международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экоситем «Pontus Euxinus   2011», посвященной 140-летию Института биологии южных морей Национальной академии наук Украины.   Севастополь, 2011.   С. 121-122 (0,04 п.л., 100 %).

11. Карапетьян О.Ш. Зависимость состояния системы биотрансформации печени пиленгаса Азовского моря от физиологического состояния вида и степени антропогенного загрязнения водоема // Сборник материалов V Международной студенческой научно-практической конференции «Интеллектуальный потенциал XXI века: ступени познания». Часть 1.   Новосибирск, 2011.   С. 22-25 (0,16 п.л., 100 %).

12. Карапетьян О.Ш., Гаврицков В.Ю., Дудкин С.И. Активность глутатион-S-трансферазы в печени рыб из различных районов Азовского моря // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы водной токсикологии: матер. конф. 17-19 мая 2011 года, г. Петрозаводск».    Петрозаводск, 2011.   С. 67-69 (0,16 п.л., 70 %).

13. Карапетьян О.Ш., Цема Н.И., Дудкин С.И. Использование показателей детоксикационной и антиоксидантной систем печени бычка-кругляка Neogobius melanostomus для биоиндикации хронического загрязнения Таганрогского залива // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы водной токсикологии: матер. конф. 17-19 мая 2011 года, г. Петрозаводск».   Петрозаводск, 2011.   С. 70-73 (0,16 п.л., 60 %).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГSH – восстановленный глутатион

ГSТ – глутатион-S-трансфераза

ГПСИ – гепатосоматический индекс

ГСИ – гонадосоматический индекс

ДДТ – 1,1-ди(4-хлорфенил)-2,2,2,-трихлорэтан

КДБА – коэффициент донной биологической аккумуляции

КН – коэффициент накопления

Ку – коэффициент упитанности

НУ – нефтяные углеводороды

ПХБ   полихлорбифенилы

СЗГ – стадия зрелости гонад

ТМ – тяжелые металлы

ХОП – хлорорганические пестициды