Карапетьян ольга шаваршевна биомаркерная оценка состояния популяции бычка-кругляка neogobius melanostomus

В данной главе приводится краткая характеристика загрязнения приоритетными токсикантами воды и донных отложений в районах исследования. Дана сравнительная характеристика маркеров биоаккумуляции бычка-кругляка в районах исследования. Показано, что в печени бычка-кругляка приоритетные токсиканты биоаккумулируются в наибольшей степени, даже при сравнительно низких их концентрациях в окружающей среде.

Морфометрические (органо-соматические) показатели рыб играют очень важную роль при характеристике благополучия популяции, так как они могут показывать обеспеченность кормовой базой, репродуктивный статус и возрастной состав (Adams, McClean, 1985).

Анализ гепатосоматических (ГПСИ), гонадосоматических (ГСИ) индексов и коэффициента упитанности (Ку) бычка-кругляка в 2010-2011 гг. показал зависимость величин этих показателей от степени зрелости рыб (таблица 3).
Таблица 3

Морфометрические показатели рыб в районах отлова в 2010 и 2011 гг.

Наименьшие значения коэффициента упитанности были у самок IV, IV-V стадии зрелости, отловленных в районе ст. Должанской и Таманском заливе в 2011 г. Согласно литературным данным у рыб (в особенности у самок), находящихся в IV, IV-V стадии зрелости, происходит снижение Ку в связи с увеличением энергетических затрат на созревание половых продуктов (Atobatele et al., 2011; Osman et al., 2011). Корреляционный анализ выявил наличие отрицательной зависимости между значениями коэффициента упитанности и гонадосоматическим индексом (r_S=-0,9, p<0.05) и положительной связи между Ку и гепатосоматическим индексом (r_S=0,87, p<0.05).

Гепатосоматические индексы самцов II стадии зрелости были достоверно выше ГПСИ самцов с III и III-IV степенью зрелости гонад. Подобные различия наблюдались и у самок (например, у самок Темрюкского порта). Была обнаружена отрицательная корреляционная связь между показателями ГПСИ и ГСИ (r_S=-0,76, p<0.05). В преднерестовый период печень значительно увеличивается в размерах, в особенности у самок, так как в ней идут процессы обеспечения вителлогенеза для последующего нереста (Arnott et al., 2000). В период нереста происходит снижение ГПСИ из-за расходования энергетических запасов печени на созревание половых продуктов (Osman et al., 2011).

Гонадосоматический индекс определялся у рыб в период нереста в июне 2011 г. В ряде районов отлова рыб встречались не готовые к нересту особи с половыми продуктами II стадии зрелости. В районе с. Весело-Вознесеновка в улове присутствовали самцы II стадии зрелости с очень низкими показателями ГСИ. В районе п. Ачуево и в Темрюкском порту в уловах присутствовали самки II стадии зрелости, не готовые к нересту, со средними значениями гонадосоматического индекса 0,05 % и 1,04 % соответственно. По некоторым литературным данным (Кошелев, 1965; Шихшабеков и др., 2006) присутствие в нерестовом стаде особей с половыми продуктами I-II стадии зрелости является специфичным для видов рыб с непрерывным икрометанием и несет приспособительной характер, так как позволяет молоди лучше использовать кормовые ресурсы. С другой стороны, недозрелость половых продуктов может быть связана с недостаточностью питания в преднерестовое время (Ращеперин, 1967).

Основная масса отловленных в июне 2011 г. самцов была III, III-IV, IV стадии зрелости. ГСИ таких самцов варьировал от 0,57 % (самцы с III-IV СЗГ в пос. Ачуево) до 1,38 % (самцы с IV СЗГ в районе порта г. Таганрога). ГСИ самок IV, IV-V стадий зрелости были достоверно выше ГСИ самцов. Наименьшее среднее значение гонадосоматического индекса наблюдалось у самок IV стадии зрелости из Темрюкского порта (5,31 %), наибольшее – у самок IV-V стадии зрелости побережья г. Тамань (18,2 %). Наблюдаемые величины ГСИ у бычка-кругляка согласуются с данными, полученными при изучении органосоматических индексов бычка-кругляка Среднего Каспия (Шихшабеков и др., 2006).

Несмотря на значительную зависимость величины органо-соматических индексов от репродуктивного статуса, нами были выявлены корреляционные связи этих показателей с уровнями персистентных ксенобиотиков в печени рыб (таблица 4).

Корреляционные связи между органо-соматическими индексами и маркерами биоаккумуляции в печени бычка-кругляка

Уменьшение ГПСИ при увеличении КН ХОП в печени рыб, с одной стороны, может свидетельствовать о потерях гликогена печени при расходовании его в качестве источника энергии для выведения ксенобиотиков из организма (Bainy et al., 1996). С другой стороны, снижение ГПСИ может быть связано с гистопатологическими изменениями в печени, включающими разрушение и дегенерацию гепатоцитов (Ram, Singh, 1988). ХОП могут запускать в печени процессы перекисного окисления липидов, в результате образующиеся свободные радикалы нарушают работу ферментов эндоплазматического ретикулума, что приводит к снижению детоксикационной функции печени и к увеличению накопления ксенобиотиков (Recknagel, Ghoshal, 1966).

Наличие у самцов отрицательной корреляционной связи между накоплением ХОП в организме рыб и величиной гепатосоматического индекса объясняет низкие величины ГПСИ у самцов бычка III, III-IV, IV стадии зрелости в 2011 г. в районах Таганрогского порта, ст. Должанской и к. Долгой. Накопление хлорорганических пестицидов может влиять на гормональный статус рыб, изменяя соотношение эстрогенов и андрогенов, а также может вызывать снижение ГСИ через истощение энергетических запасов организма (Feist et al., 2005). Принимая во внимание обнаруженные корреляционные взаимодействия, можно объяснить минимальные значения ГСИ у самцов кругляка IV стадии зрелости, отловленных в районах п. Ачуево и Темрюкского порта.

Таким образом, использование морфометрических показателей в качестве биомаркеров загрязнения и репродуктивного статуса бычка-кругляка в комплексе с данным химического анализа выявило негативное влияние биоаккумуляции хлорорганических пестицидов и нефтяных углеводородов на организм гидробионтов. Результаты показали, что процессы накопления персистентных органических ксенобиотиков находятся в прямой взаимосвязи со снижением репродуктивного потенциала бычка-кругляка.

Биохимические исследования гидробионтов позволяют выявить негативное влияние неблагоприятных факторов на начальных этапах их воздействия, так как на молекулярном уровне организмы способны очень быстро реагировать на изменения факторов среды обитания.

Результаты многолетнего исследования динамики уровня микросомальных цитохромов и активности глутатион-S-трансферазы в печени рыб позволили выявить некоторые различия в функционировании компонентов системы биотрансформации печени бычка-кругляка в сравнении с другими видами рыб Азовского моря (Карапетьян и др., 2010; Карапетьян и др., 2011; Карапетьян, 2011).

На активность ферментов биотрансформации способны оказывать влияние как экзогенные, так и эндогенные факторы различной природы, в связи с чем даже в пределах одного вида может наблюдаться значительная вариабельность исследуемого показателя. Отбор проб осуществлялся в мае-июне каждого года, то есть в разгар нерестового хода для исследуемых видов. Исследуемые особи находились в сходном физиологическом состоянии.

Для бычка-кругляка вариабельность уровня и активности компонентов первой и второй фаз биотрансформации в печени в большей степени была заметна между разными районами исследования и годами (таблица 5).
Таблица 5

Показатели системы биотрансформации печени бычка-кругляка Азовского моря,

2005-2007 гг.

Можно предположить, что центральные районы Азовского моря характеризуются меньшей биодоступностью загрязнения вследствие особенностей глинистой составляющей основы грунтов, при этом побережье Азовского моря характеризуется наибольшей интенсивностью прямого поступления приоритетных токсикантов (Кленкин и др., 2007). В течение всего периода исследований наблюдались значительные колебания исследуемых показателей в печени кругляка. В то же время нельзя говорить о нарушении внутреннего гомеостаза рыб в связи с гиперактивацией ферментов биотрансформации в некоторых районах исследования. Полученные результаты, скорее всего, свидетельствуют о широких адаптационных возможностях ферментных систем печени данного вида рыб. Такое свойство, в свою очередь, может благоприятно влиять на выживаемость вида в условиях загрязнения, так как уровень и активность ферментов биотрансформации определяет степень негативного влияния ксенобиотиков на организм (Юрин, 2002).

Так как достоверных различий в исследуемых показателях между особями с разным репродуктивным статусом у всех исследуемых видов обнаружено не было, на рисунках 3 и 4 приведены средние величины по каждой выборке без учета пола и стадии зрелости. При сравнении суммарного содержания цитохромов P450 и P420 в печени разных видов рыб, наиболее высокие значения обнаруживались в печени камбалы-калкан.

Рис. 3. Суммарное содержание цитохромов P450 и P420 в печени разных видов рыб в период 2005-2007 гг.

В 2005 г. в центральном районе моря содержание микросомальных цитохромов в печени осетра и севрюги достоверно не отличалось от таковых пиленгаса и бычка-кругляка. В 2006 г. достоверных различий не было обнаружено для показателей кругляка и судака.

Таким образом, кругляк демонстрирует уровни микросомальных цитохромов в печени сопоставимые с таковыми других важных промысловых видов. Данное наблюдение подтверждает возможность распространения результатов, полученных на бычке-кругляке, на другие виды рыб, имеющих более важное промысловое значением, но добыча которых для лабораторных исследований представляет определенные трудности. В тоже время при интерпретации результатов необходимо учитывать степень миграционной активности осетра и судака.

Картина динамики изменения активности ГSТ в печени разных видов рыб отличалась большей неоднородностью, чем для предыдущего показателя. На рисунке 4 показано, что для кругляка были характерны более высокие значения этого показателя в печени, чем для пиленгаса, осетра, севрюги, судака и камбалы-калкан. В тоже время, показатели кругляка и осетра достоверно не отличались друг от друга. Наименьшие величины активности определялись в печени камбалы-калкан (0,05-0,15 мкМоль/мг белка фракции S9*мин.).

в период 2005-2007 гг.

Корреляционный анализ не выявил наличия корреляционных взаимосвязей между ферментами первой и второй фазы биотрансформации ни для одного вида рыб.

Таким образом, выявленные внутривидовые и межвидовые различия в функционировании ферментов первой и второй фазы биотрансформации в печени рыб, прежде всего, связаны с их генетическими, физиологическими особенностями, а также со спектром адаптационных возможностей. У бычков основная часть жировых отложений располагается в печени, где и происходит концентрирование основных групп приоритетных токсикантов – индукторов системы биотрансформации. Высокое содержание и активность ферментов системы биотрансформации у бычка-кругляка по сравнению с рыбами других видов, очевидно, позволяет ему лучше адаптироваться к обитанию в условиях загрязнения за счет активного метаболизма и выведения ксенобиотиков.
3.3.2. Оценка показателей микросомальной гидроксилирующей системы в печени бычка-кругляка в 2010-2011 гг.

Результаты биохимических исследований в 2010-2011 гг. показали, что уровень содержания микросомальных цитохромов печени бычка-кругляка, выловленного в выбранных точках Азовского моря, Таганрогского и Таманского заливов, не превышал значения прошлых лет (Карапетьян, 2010). В таблице 6 приведены данные по содержанию микросомальных цитохромов в печени кругляка Таганрогского залива в разные периоды исследования.

Содержание микросомальных цитохромов в печени бычка-кругляка Таганрогского залива в мае-июне 2006-2011 гг., нМоль/мг белка микросом

Из таблицы 6 видно, что уровень цитохрома Р420 в печени бычка-кругляка во все периоды исследования был выше содержания цитохрома Р450. Такое соотношение активной и неактивной форм может быть вызвано несколькими причинами. Первая причина, возможно, связана с накоплением в печени тяжелых металлов, металлов переменной валентности и других ксенобиотиков, способных инициировать свободнорадикальные процессы, нарушать фосфолипидное микроокружение цитохрома Р450 и вызывать его конверсию в каталитически инертную форму Р420 (Sigel et al., 2007). Также частичная инактивация Р450 может происходить в период между отбором проб и проведением измерений (Porte et al., 2000).

В процессе анализа результатов не было выявлено достоверных половых различий в уровнях содержания компонентов микросомальной гидроксилирующей системы. Достоверные отличия отсутствовали и между особями разной стадии зрелости.

В тоже время, согласно данным литературы (Andersson, Forlin, 1992), активность компонентов микросомальной гидроксилирующей системы и отдельных изоформ цитохрома P450 может различаться у особей с различным репродуктивным статусом. Другие авторы указывают на наличие половых различий только на уровне отдельных изоформ цитохрома P450. Они отмечают, что эстрогены, уровень которых резко возрастает в крови нерестящихся самок, способны ингибировать некоторые изоформы цитохрома P450 (в частности, CYP1A1) (Andersson, 1990). Для самок IV, IV-V стадии с помощью корреляционного анализа была выявлена зависимость между морфометрическими показателями особей и уровнем ферментов биотрансформации (таблица 7).

Корреляция (r_S, p<0.05) показателей печени с морфометрическими показателями самок бычка-кругляка IV, IV-V стадии зрелости

Данные таблицы 7 подтверждают наличие взаимосвязи между полом и стадией зрелости, с одной стороны, и уровнем исследуемых биохимических показателей с другой. С возрастанием гонадосоматического индекса, то есть с увеличением степени зрелости, у самок происходит снижение содержания ферментов I фазы биотрансформации в печени.

В 2010 г. у бычков из района Таганрогского порта содержание микросомальных цитохромов в печени рыб было несколько ниже ожидаемого (рис. 5), поскольку в тканях, в том числе и в печени, у рыб данного района были обнаружены аналитически значимые уровни полихлорбифенилов, хлорорганических пестицидов, нефтяных углеводородов – известных индукторов I фазы системы биотрансформации.

Рис. 5. Содержание микросомальных цитохромов в печени бычка-кругляка в разных районах Азовского моря в 2010 г.
В 2011 г. содержание компонентов микросомальной гидроксилирующей системы в печени бычка-кругляка колебалось в незначительных пределах (рис. 6).

Среднее содержание цитохрома b5 в печени рыб в 2011 г. варьировало в пределах от 0,07 нМоль/мг белка микросом (к. Долгая) до 0,36 нМоль/мг белка микросом (п. Ачуево). Более высокий уровень цитохрома b5 в печени рыб в п. Ачуево может быть связан с аномально высоким уровнем нефтяных углеводородов в печени бычков, выловленных в этом районе. Имеются литературные данные, свидетельствующие о том, что уровень цитохрома b5 возрастает в печени некоторых видов рыб, подвергшихся воздействию сырой нефти (Ahokas et al., 1994).

Результаты корреляционного анализа показали наличие значимых связей между уровнем ХОП в воде (r_S=0,62, p<0.05) и содержанием цитохрома P450. Увеличение содержания печеночного цитохрома P450 у разных видов рыб в ответ на воздействие ХОП, а также других классов персистентных ксенобиотиков, было обнаружено во многих исследованиях (Van der Oost et al., 2003). Можно предположить, что накопление хлорорганических пестицидов в печени бычков прибрежных районов Азовского моря вызывает адаптивное увеличение содержания микросомальных цитохромов. Увеличение количества микросомальных цитохромов ускоряет процессы биотрансформации и выведения токсикантов из организма. В то же время некоторые метаболиты ХОП (например, метаболиты ДДТ) обладают высокой степенью устойчивости к биодеградации и выведению из организма, а в ряде случаев приобретают еще более высокую токсичность в ходе биотрансформации.

Наиболее высокие концентрации ХОП в воде и в печени бычка-кругляка обнаруживались в районе с. Весело-Вознесеновка, Таганрогского и Темрюкского портов. Очевидно, относительно высокое количество компонентов микросомальной гидроксилирующей системы в печени бычков этих районов является ответной реакцией данного вида на воздействие ХОП.

В то же время, ряд авторов отмечают, что присутствие высоких концентраций персистентных органических ксенобиотиков в организме рыб в некоторых случаях может приводить к подавлению их метаболизма в печени и к снижению содержания и активности цитохрома P450 (Stegeman, Hahn, 1994; Wepener et al., 2005). Такое предположение подтверждают результаты корреляционного анализа между уровнем цитохрома P450 в печени бычка и концентрацией НУ в его организме: коэффициент корреляции между данными показателями составил -0,69 (p<0.05).

При анализе корреляционных связей с тяжелыми металлами была обнаружена отрицательная зависимость между компонентами микросомальной гидроксилирующей системы и концентрацией кадмия в печени бычков (таблица 8).
Таблица 8

Значения коэффициентов корреляции между концентрацией кадмия в печени бычка-кругляка и содержанием компонентов микросомальной гидроксилирующей системы

Согласно данным литературы тяжелые металлы способны нарушать процессы синтеза различных микросомальных цитохромов (Strydom et al., 2006). Ионные формы кадмия индуцируют гемоксигеназы, которые вызывают снижение количества цитохрома P450 (Moore, 2004). Также было показано, что кадмий является специфическим ингибитором различных изоформ цитохрома P450 (в частности, CYP2E, CYP3A и др.) (Strydom et al., 2006).

В нашем исследовании концентрации кадмия в печени рыб разных районов не превышали принятые нормативы. То есть, обнаруженное снижение содержания микросомальных цитохромов в печени бычков под влиянием кадмия свидетельствует о наличии негативных эффектов на организм рыб даже при действии сравнительно низких концентраций данного токсиканта.

Вероятно, низкие значения исследуемых показателей у бычков к. Долгой и Таманского залива связаны именно с негативным влиянием кадмия, так как в печени рыб этих районов были найдены наиболее высокие концентрации данного металла (на фоне низких значении накопления хлорорганических пестицидов).

Таким образом, использование в качестве биомаркеров загрязнения компонентов микросомальной гидроксилирующей системы позволило выявить некоторые взаимозависимости между уровнями ксенобиотиков и содержанием исследуемых показателей в печени рыб. Но в то же время, оценка влияния загрязнения на гидробионтов только по величине микросомальных цитохромов в печени (без привлечения данных химического анализа) может оказаться малоинформативной, так как на величину исследуемых показателей оказывают влияние и другие эндогенные и экзогенные факторы. Повышение информативности биомаркера может быть достигнуто путем определения отдельных изоформ CYP.