Ana səhifə

Карапетьян ольга шаваршевна биомаркерная оценка состояния популяции бычка-кругляка neogobius melanostomus


Yüklə 0.52 Mb.
səhifə1/3
tarix24.06.2016
ölçüsü0.52 Mb.
  1   2   3


на правах рукописи
карапетьян ольга шаваршевна


БИОМАРКЕРНАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПОПУЛЯЦИИ

БЫЧКА-КРУГЛЯКА NEOGOBIUS MELANOSTOMUS

В ПРИБРЕЖНЫХ РАЙОНАХ АЗОВСКОГО МОРЯ

03.02.08 – экология (биологические науки)

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону – 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону) и в отделе генетико-биохимического мониторинга Федерального государственного унитарного предприятия «Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства» (г. Ростов-на-Дону)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Внуков Валерий Валентинович

кандидат биологических наук, доцент



Дудкин Сергей Иванович
Официальные оппоненты: Бакаева Елена Николаевна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник Южного отдела Института водных проблем РАН
Чуйко Григорий Михайлович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией физиологии и токсикологии водных животных Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»), г. Владивосток

Защита диссертации состоится 30 марта 2012 г. в 17-00 на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: denisova777@inbox.ru, факс: (863)2638723).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).
Автореферат разослан « » февраля 2012 г. и размещен в сети Интернет на сайте ЮФУ www.sfedu.ru и на сайте Минобрнауки России www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.В. Денисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Азовское море   уникальный водоем, отличающийся высокой биопродуктивностью. В то же время, благодаря значительной площади водосбора, охватывающей густонаселенные районы с развитым промышленным производством и сельским хозяйством, Азовское море подвержено хроническому загрязнению антропогенными токсикантами различного химического состава. Присутствие в водной среде разнообразных по природе химических веществ, комбинация их синергических, антагонистических и маскирующих эффектов оказывает существенное влияние на жизнедеятельность и выживание гидробионтов (Лукьяненко, 1987; Руднева и др., 2004).

В свете существующей проблемы, проведение экологического мониторинга только с применением химических методов анализа становится недостаточно эффективным, так как оно не позволяет выявить все разнообразие токсических соединений в море, а главное,   не позволяет оценить отклики живых организмов на комплексное воздействие загрязнения. Поэтому в экологическом мониторинге Азовского моря важно все большее внимание уделять методам биоиндикации с использованием биомаркеров, в основе которых лежит оценка качества водной среды по состоянию ее биоты (Патин, 1979). Этот подход позволяет исследовать направленность и динамику биологических процессов в популяциях гидробионтов под воздействием всего комплекса присутствующих в среде обитания компонентов хронического загрязнения.

В качестве биоиндикатора обычно выступает определенный биологический вид, по наличию, поведению или состоянию которого судят об особенностях среды обитания и происходящих в ней естественных и антропогенных изменениях (Реймерс, 1990). Как правило, для оценки влияния загрязнения на рыбные популяции в качестве биоиндикаторов используются малоподвижные донные виды, биологические характеристики которых находятся в тесной взаимосвязи с окружающей средой.

Важное значение имеет поиск и изучение биологических маркеров у рыб-биоиндикаторов, которые позволяют эффективно оценить степень нарушений биологических функций гидробионтов, адаптивный или токсический ответ организма на качество среды обитания (Руднева и др., 2011).

В современной литературе под термином «биомаркер» подразумевают биохимические, физиологические или другие типы изменений в тканях и биологических жидкостях организма, которые происходят под воздействием токсиканта, а также наследственные или приобретенные характеристики организма, определяющие его способность реагировать в ответ на вредное воздействие токсиканта (National Research Council, 1987). В то же время, количество в организме ксенобиотика, его метаболитов или продуктов его взаимодействия с биологическими молекулами обозначают термином «маркеры биоаккумуляции» (Van der Oost et al., 2003).

Как правило, исследования с использованием биомаркеров биоиндикаторных видов дают более полную информацию о неблагоприятных эффектах на гидробионтов со стороны среды обитания. В тоже время, использование данных химического анализа воды, донных отложений в комплексе с маркерами биоаккумуляции и биомаркерами вида-биоиндикатора в мониторинге водоемов позволяет не просто определить количество и класс токсических соединений в экосистеме, но и оценить биологический ответ сообщества или популяции гидробионтов на воздействие определенных групп токсикантов.

Выделение биоиндикаторных видов рыб в Азовском море и исследование изменений их биомаркеров под влиянием комплексного загрязнения является актуальным и представляет собой важнейший этап в разработке программ хозяйственного использования водоема и мероприятий по его охране.

В нашем исследовании в качестве биоиндикатора загрязнения был выбран широко распространенный в Азовском море вид – бычок-кругляк Neogobius melanostomus (Pallas, 1814), соответствующий всем основным требованиям, предъявляемым к биоиндикаторам.



Цель работы состояла в биомаркерной оценке состояния популяции бычка-кругляка в прибрежных районах Азовского моря с разным уровнем загрязнения приоритетными токсикантами.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить ксенобиотические профили районов исследования, используя маркеры биоаккумуляции тканей рыб и данные химического анализа воды и донных отложений. Определить взаимосвязь между уровнем приоритетных токсикантов в среде обитания и их накоплением в печени и мышцах бычка-кругляка.

2. Определить взаимосвязь между маркерами биоаккумуляции печени бычка-кругляка и биомаркерами разного уровня, используя корреляционный анализ.

3. Провести сравнительный анализ молекулярных биомаркеров системы биотрансформации ксенобиотиков в печени бычка-кругляка с таковыми других видов рыб Азовского моря.

4. Установить зависимость показателей органо-соматических индексов и молекулярных биомаркеров системы биотрансформации и антиоксидантной защиты печени от физиологического состояния и репродуктивного статуса бычка-кругляка.

5. Охарактеризовать межгодовую динамику молекулярных биомаркеров системы биотрансформации печени бычка-кругляка.

6. Показать информативность морфометрических и биохимических биомаркеров для характеристики эколого-биохимического состояния бычка-кругляка Азовского моря и среды его обитания.

7. Используя биомаркеры разного уровня, дать комплексную оценку влияния загрязнения приоритетными токсикантами на состояние популяции бычка-кругляка в прибрежных районах Азовского моря.

8. Показать перспективность использования бычка-кругляка в качестве биоиндикатора загрязнения Азовского моря.



Научная новизна. Впервые исследованы органо-соматические индексы и биохимические показатели печени бычка-кругляка прибрежных акваторий Азовского моря, Таганрогского и Таманского заливов во взаимосвязи с маркерами биоаккумуляции печени и ксенобиотическим профилем среды обитания. Установлена зависимость морфометрических биомаркеров и молекулярных биомаркеров системы биотрансформации и антиоксидантной защиты печени бычка-кругляка от пола и репродуктивного статуса особей. Выявлены межвидовые различия показателей молекулярных биомаркеров печени разных видов рыб Азовского моря. Доказана перспективность использования морфометрических и молекулярных биомаркеров бычка-кругляка при мониторинге состояния водных экосистем.

Положения, выносимые на защиту.

1. Величина органо-соматических индексов (морфометрических биомаркеров) и молекулярных биомаркеров системы биотрансформации и антиоксидантной защиты печени бычка-кругляка Азовского моря находится в тесной взаимосвязи с репродуктивным статусом рыб и уровнем накопления в печени приоритетных токсикантов.

2. Широкий диапазон изменений содержания микросомальных цитохромов и глутатион-S-трансферазы в печени бычка-кругляка Азовского моря позволяет ему легче адаптироваться к обитанию в условиях загрязнения за счет активного метаболизма и выведения ксенобиотиков из организма.

3. Действие приоритетных токсикантов в некоторых прибрежных районах Азовского моря превосходит адаптационные возможности бычка-кругляка. Накопление неблагоприятных эффектов при действии ксенобиотиков на молекулярном уровне в некоторых исследованных районах приводит к возникновению морфологических отклонений и к снижению репродуктивного потенциала особи. Нарушение репродуктивной функции отдельных особей в конечном итоге сказывается на воспроизводстве всей популяции бычка-кругляка Азовского моря и приводит к снижению эффективности размножения на популяционно-видовом уровне.

4. Анализ изменений морфометрических и молекулярных биомаркеров бычка-кругляка Азовского моря и их корреляционная взаимосвязь с маркерами биоаккумуляции приоритетных токсикантов позволяют оценить степень благополучия популяции данного вида в среде его обитания.

5. Использование бычка-кругляка в качестве вида-биоиндикатора позволяет не только получить интегральную оценку качества среды его обитания, но и отследить изменения, происходящие в экосистеме моря в результате антропогенного воздействия.



Научно-теоретическое и практическое значение результатов исследования. Выполненное исследование раскрывает некоторые механизмы негативного влияния антропогенного загрязнения Азовского моря на биологическую продуктивность бычка-кругляка.

Результаты исследований внедрены и используются при проведении мониторинговых исследований Азово-Черноморского бассейна в отделе генетико-биохимического мониторинга ФГУП «АзНИИРХ». Исследования 2010-2011 гг. проводились в рамках календарного плана работ по государственным контрактам ФГУП «АзНИИРХ» с Федеральным агентством по рыболовству № 4-01/2010 и № 4-01/2011 «Биоресурсы и рыболовство», п/п 08.04.

Результаты работы могут быть использованы при проведении мониторинговых исследований также и других водоемов России с целью оценки воздействия загрязнения на промысловые виды рыб и прогноза продуктивности популяций промысловых видов при антропогенной трансформации водных объектов.

Результаты работы могут найти применение при разработке ПДК загрязняющих веществ для рыбохозяйственных водных объектов.



Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании общих и специальных курсов: «Биохимия», «Ферментология», «Основы патобиохимии», «Свободные радикалы в живых системах» на кафедре биохимии и микробиологии факультета биологических наук Южного федерального университета и могут быть использованы в учебном процессе в других вузах.

Личный вклад автора. Диссертационная работа является обобщением результатов исследований автора, проведенных в 2005-2011 гг. Тема, цель, задачи, объекты, методы и программа исследования определены автором совместно с научными руководителями. Все биохимические и морфометрические методы исследования освоены автором, и все из них применялись в диссертационной работе им лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и основных защищаемых положений сделаны лично автором при направляющем и корректирующем участии научных руководителей.

Апробация работы. Результаты и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на IV Всероссийской школе по морской биологии «Комплексные гидробиологические базы данных: ресурсы, технологии и использование» (Азов, 2005); на IX Съезде Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 2006); на Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006); на 62-ой Международной научной конференции биолого-почвенного факультета Южного федерального университета (Ростов-на-Дону, 2006); на 5-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: «Молодежь XXI века – будущее российской науки» (Ростов-на-Дону, 2007); на Международной научной конференции «Современное состояние водных биоресурсов и экосистем морских и пресноводных вод России: проблемы и пути решения» (Ростов-на-Дону, 2010); на VII Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus-2011», посвящённой 140-летию Института биологии южных морей Национальной академии наук Украины (Севастополь, 2011); на V Международной студенческой научно-практической конференции «Интеллектуальный потенциал XXI века: ступени познания» (Новосибирск, 2011); на Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы водной токсикологии» (Петрозаводск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, объемом 2,8 п.л., из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК. Доля участия автора в публикациях составляет 81,5 % (2,28 п.л.).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы содержит 321 источник, в том числе 237 иностранных. Общий объем работы составляет 183 страницы. Диссертация включает 22 таблицы и 34 рисунка.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям: зав. кафедрой биохимии и микробиологии, д.б.н., профессору Внукову В.В. и зам. директора по научной работе ФГУП «АзНИИРХ», к.б.н., доценту Дудкину С.И. за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации; зав. отделом генетико-биохимического мониторинга, д.б.н., профессору Корниенко Г.Г. за помощь в организации работы, конструктивные замечания и предложения; зам. директора по научной работе ФГУП «АзНИИРХ», д.б.н., профессору Корпаковой И.Г. за проявленный интерес к работе, помощь и полезные замечания; старшему научн. сотр. отдела генетико-биохимического мониторинга ФГУП «АзНИИРХ» Цеме Н.И. за постоянную поддержку, помощь в отборе проб и проведении лабораторных исследований; сотрудникам лаборатории аналитического контроля водных экосистем Аналитического центра ФГУП «АзНИИРХ»: к.б.н. Коротковой Л.И., к.б.н. Павленко Л.Ф. и Кораблиной И.В. за проведение химического анализа отобранного материала; зав. лабораторией регламентации пестицидов ФГУП «АзНИИРХ» Бугаеву Л.А. за помощь в организации научных экспедиций; к.б.н., зав. лабораторией разработки ОБУВ и токсикометрии ФГУП «АзНИИРХ» Левиной И.Л. за ценные методические советы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе охарактеризовано экологическое состояние Азовского моря и указаны основные источники антропогенного загрязнения данного водоема. Дана характеристика процессов биоаккумуляции, биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков в организме рыб. Обсуждена роль использования морфометрических и молекулярных биомаркеров системы биотрансформации и антиоксидантной защиты печени рыб в мониторинге загрязнения водоемов и при оценке функционального состояния гидробионтов в условиях комплексного загрязнения среды их обитания.


2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В главе дана краткая характеристика объекта исследования бычка-кругляка.

В 2005-2007 гг. с целью выявления динамики активности ферментов биотрансформации в печени разных видов рыб Азовского моря было исследовано 258 особей рыб 6 различных видов: пиленгаса Liza haematocheilus, осетра Acipenser gueldenstaedtii, камбалы-калкан Psetta maeotica torosus, бычка-кругляка, севрюги Acipenser stellatus, судака Sander lucioperca. Отбор опытного материала производился в различных районах собственно Азовского моря и Таганрогского залива. Станции отбора были равномерно расположены на акватории разных районов моря. Границы каждого района Азовского моря и Таганрогского залива приняты постоянными, доли площадей отдельных районов и объемов их водных масс в общей морфометрии моря тоже постоянны (Кленкин и др., 2007). Это позволило получить среднеарифметические значения исследуемых показателей у рыб отдельных районов. Районы исследования в 2005-2007 гг. представлены на рисунке 1.

Информация о выборках разных видов рыб районов исследования в период 2005-2007 гг. представлена в таблице 1.



Рис. 1. Районы отбора материала исследований в период 2005-2007 гг.

Примечание: Районы Таганрогского залива: 1 – восточный; 2 – центральный; 3 – западный; и собственно моря: 4 – северный; 5 – западный; 6 – южный; 7 – центральный; 8 – восточный.


Таблица 1

Количество исследованных особей разных видов рыб Азовского моря, отобранных



в период 2005-2007 гг.


Период

Вид рыбы

Район отбора

Кол-во особей

Определяемые показатели

Май-июнь 2005 г.


Пиленгас

Центр. СМ

16

Активность глутатион-S-трансферазы, содержание цитохромов P450, P420 и b5 в печени, концентрация белка постмитохондриальной и микросомальной фракций

Южный СМ

53

Осетр

Центр. СМ

21

Камбала калкан

Центр. СМ

3

Продолжение таблицы 1


Период

Вид рыбы

Район отбора

Кол-во особей

Определяемые показатели

Май-июнь 2005 г.


Бычок-кругляк

Вост. СМ

4

Активность глутатион-S-трансферазы, содержание цитохромов P450, P420 и b5 в печени, концентрация белка постмитохондриальной и микросомальной фракций

Западн. СМ

12

Северн. СМ

6

Центр. СМ

6

Севрюга

Центр. СМ

4

Май-июнь 2006 г.

Пиленгас

Вост. СМ

17

Осетр

Вост. СМ

4

Бычок-кругляк

Вост. СМ

28

Западн. ТЗ

25

Судак

Вост. СМ

12

Май-июнь, 2007 г.

Пиленгас

Центр. СМ

11

Бычок-кругляк

Центр. СМ

9

Северн. СМ

10

Вост. СМ

10

Западн. ТЗ

7

В основе настоящей работы лежат результаты, полученные в исследованиях 2010-2011 гг. В течение 2010-2011 гг. осуществлялся отлов бычка-кругляка в прибрежных частях Таганрогского залива, Азовского моря и Таманского залива (рис. 2).



Рис. 2. Карта-схема района работ и расположения точек отбора проб


Примечание:   точка отбора материала исследования

На исследование было отобрано 206 самцов и 50 самок с различной стадией зрелости гонад (таблица 2). Одновременно в каждом районе проводили отбор проб воды, грунта и рыб для определения в них уровня приоритетных токсикантов.
Таблица 2

Характеристика исследованных выборок и показателей бычка-кругляка Азовского моря в 2010 и 2011 гг.




Период

Кол-во особей

Определяемые показатели

Сентябрь 2010 г.

94

Гонадосоматический, гепатосоматический индексы, коэффициент упитанности, содержание основных классов ксенобиотиков в печени и мышцах, активность глутатион-S-трансферазы, содержание цитохромов P450, P420 и b5 в печени, содержание восстановленного глутатиона, концентрация белка

Июнь 2011 г.

162

Стадии зрелости гонад оценивали визуально по шестибалльной шкале (Сакун, Буцкая, 1963). Величину ГПСИ рассчитывали как отношение массы печени к массе рыбы, выраженное в процентах (Htun-han, 1978). ГСИ вычисляли как отношение массы гонад к массе рыбы, выраженное в процентах (Шевелев, 2001). Для определения упитанности рыб пользовались формулой Кларк (Мина, Клевезаль, 1976).

Печень рыб после извлечения из тела немедленно помещали в пробирки Эппендорф и замораживали в жидком азоте при -196°С в сосуде Дьюара. Навеску образцов замороженной ткани печени гомогенизировали при скорости 2000 об./мин. с добавлением ледяного раствора хлорида калия (1,15 %). Для выделения постмитохондриальной фракции (фракция S9) полученный гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. в условиях охлаждения до +4°С.

Выделение общей микросомальной фракции производили методом низкоскоростного центрифугирования (Albro et al., 1987).

Содержание микросомальных цитохромов b5, Р450 и Р420 определяли по методу Omura и Sato (1964), активность глутатион-S-трансферазы (ГSТ) постмитохондриальной фракции (фракция S9)   по методике Sen и Kirikbakan (2004), содержание восстановленного глутатиона по методу Ellman (1959), содержание белка   методом Bradford (1976).

Исследования на наличие приоритетных токсикантов проводились автором совместно с сотрудниками лаборатории аналитического контроля водных экосистем ФГУП «АзНИИРХ» в 2010 и 2011 гг. согласно календарному плану работ по государственным контрактам ФГУП «АзНИИРХ» с Федеральным агентством по рыболовству № 4-01/2010 и № 4-01/2011 «Биоресурсы и рыболовство», п/п 08.04.

Автором лично осуществлялось планирование работы, отбор образцов проб воды, донных отложений и бычков производился совместно с участниками комплексной экспедиции.

Аналитическое определение содержания токсикантов выполнялось сотрудниками лаборатории аналитического контроля водных экосистем. В воде, донных отложениях и тканях рыб (печени и мышцах) проводилось определение содержания нефтяных углеводородов (НУ), хлорорганических пестицидов (ХОП), полихлорбифенилов и некоторых тяжелых металлов (ТМ). Все методики внесены в Федеральный реестр.

Анализ, обобщение, статистическая обработка и сопоставление с литературными источниками результатов, полученных сотрудниками лаборатории, осуществлялись автором лично.

На основании полученных данных производилась оценка загрязненности воды комплексом приоритетных токсикантов с использованием показателя комплексной загрязненности воды (КЗВ) (Кленкин и др., 2007).

На основании аналитических данных рассчитывались следующие коэффициенты (Брагинский, 2004): 1) коэффициент накопления печени (КН); 2) коэффициент донной аккумуляции (КДА); 3) коэффициент донной биологической аккумуляции печени (КДБА).

Статистическую обработку полученных данных проводили, используя стандартный пакет программ MS Office Excel 2007 и STATISTICA 8. Достоверность различий между выборками оценивали по U-критерию Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0.05. С целью выявления зависимости между исследованными параметрами рассчитывали коэффициент корреляции Спирмана (rS) (Лакин Г.Ф., 1990). Корреляционную связь считали достоверной при уровне значимости p<0.05.


  1   2   3


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©atelim.com 2016
rəhbərliyinə müraciət