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Danagenezol total rna purification kit


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DANAGENEZOL TOTAL RNA PURIFICATION KIT



REF.0803 100 EXTRACCIONES
1.INTRODUCTION


    1. Descripción del producto

DANAGENEZOL TOTAL RNA PURIFICATION kit provee un rápido método para la extracción y purificación de ARN total a partir de células animales, tejidos animales, sangre, bacterias, levaduras, hongos, fluidos biológicos y plantas. El kit permite purificar todas las especies de ARN, desde el ARN ribosomal y ARNm hasta el microARN (miARN) y el ARN de intereferencia (ARNi).


La mayoría de kits comerciales no poseen la capacidad de recuperar las moléculas de ARN < 200 nucleótidos, una fracción enriquecida en especies de ARN < 200 nucleótidos puede obtenerse con el DANAGENEZOL TOTAL RNA PURIFICATION kit.
La purificación se basa en “spin column chromatography” utilizando una matriz como resina de separación. El ARN es preferentemente purificado frente a otros componentes celulares como las proteínas sin el uso de fenol y cloroformo. El proceso implica primero lisar las células o tejidos de interés con la Solución de Lisis, luego se añade etanol al lisado y la solución es pasada por la columna.

De este modo, el ARN se une a la columna (una pequeña cantidad de ADN genómico también es presente) mientras que las proteínas contaminantes serán eliminadas, después el ARN unido es lavado con la Solución de lavado que se suministra para eliminar las impurezas remanentes, y el ARN total purificado es eluido con agua libre de nucleasas.




    1. Componentes del kit






Tª Stock

Solución de Lisis RNA

40 ml

15-25ºC

Solución de Lavado RNA*

38 ml

15-25ºC

Tampón de Elución RNA

6 ml

15-25ºC

Columna de RNA

100 unid.

15-25ºC

Microtubos de recogida

200 unid.

15-25ºC



*Ver en el apartado de preparaciones preeliminares como preparar estas soluciones





    1. Equipos y reactivos necesarios y no provistos




  • Etanol 100 %

  • Etanol 70 %

  • Microcentrifuga.

  • Microtubos de 1. 5 ml y 2.0 ml.

  • Homogenizadores generales para homogenizar tejidos animales y de plantas.

  • Nitrógeno líquido.

  • -mercaptoetanol.


1.4Almacenamiento y estabilidad

  • Todos los componentes son estables durante 12 meses desde la fecha de la compra siendo almacenados como se indica.


ATENCION: La solución de Lisis RNA contiene guanidine isotiocianato que es irritante, utilizar guantes y gafas.
2. PROTOCOLO

2.1 Preparaciones preeliminares

  • Añadir Etanol 100 % a la Solución de Lavado RNA indicado en la etiqueta, unos 87 ml con lo que el volumen final será de 125 ml .Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol.

  • Asegurarse que todas las soluciones se encuentran a temperatura ambiente.

  • OPCIONAL: El uso de -mercaptoetanol en la lisis es altamente recomendado para tejidos animales, particularmente en aquellos que se sabe que tienen un alto contenido en RNAsas (ejem.páncreas), al igual que en tejidos de plantas. También se recomienda para aquellos usuarios que quieren aislar RNA para aplicaciones muy sensibles o enriquecimiento de microRNA. Preparar una cantidad apropiada de Tampón de Lisis RNA añadiendo 10 l de -mercaptoetanol por 1 ml de Solución de Lisis RNA. Alternativamente, la Solución de Lisis RNA puede ser utilizada tal y como es suministrada.


2.2 Protocolo de extracción de ARN total a partir de células animales en cultivo

Nota: La máxima cantidad recomendada de células es 3 x 106 . Pellets de células pueden ser conservados a -70ºC para un uso posterior (determinar el número de células antes de congelar). Los pellets congelados no deberán ser conservados más de 2 semanas para asegurar que la integridad del ARN no se verá comprometida. El Tampón de lisis RNA se añadirá directamente sobre los pellets congelados sin dejar que alcancen la temperatura ambiente.
1.A) Extracción ARN total de células creciendo en monocapa

  1. Aspirar el medio y lavar las células con una cantidad apropiada de PBS.Aspirar el PBS.

  2. Añadir directamente 350l de Solución de Lisis RNA directamente a la placa de cultivo.

  3. Lisar las células, tapar la placa y agitar el tampón alrededor de la superficie de la placa durante 5 minutos. Para cantidades mayores a 106 células se recomienda pasar el lisado 5 o 10 veces a través de una jeringa con una aguja de 25.

  4. Pasar el lisado a un microtubo.

  5. Añadir 200 l de etanol 95-100% al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos.

  6. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  8. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 7.

  9. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  10. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  11. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  12. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  13. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  14. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  15. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.


1.B) Extracción de ARN total de células creciendo en solución


  1. Transferir la suspensión celular a un tubo libre de RNAsas (no suministrado) y centrifugar a no más de 200x g (aprox. 2.000 rpm) durante 10 minutos para pellet las células.

  2. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante.

  3. Añadir 350 l de Solución de Lisis RNA al pellet. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse que todo el pellet está disuelto antes de proceder con el siguiente paso. Para cantidades mayores a 106 células se recomienda pasar el lisado 5 o 10 veces a través de una jeringa con una aguja de 25.

  4. Añadir 200 l de etanol 95-100% al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos.

  5. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  6. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  7. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 6.

  8. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  9. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  10. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  12. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  13. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  14. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.



2.3 Protocolo de extracción de ARN total a partir de tejidos animales.

Nota: El ARN en tejidos animales no se encuentra protegido hasta que después de su recolección es roto y homogenizado en la Solución de Lisis. Tejidos frescos o congelados pueden ser utilizados para este procedimiento.Los tejidos deberían congelarse en nitrógeno líquido y transferidos inmediatamente a -70ºC. Cuando aislamos ARN de tejidos congelados asegurase que no desciende mucho su temperatura durante el pesaje y la pulverización con una mano de mortero.


  1. Determinar la cantidad de tejido a pesar , se recomienda no utilizar más de 10 mg de tejido.

  2. Colocar el tejido en un mortero que contenga una cantidad apropiada de nitrógeno líquido para cubrir la muestra. Pulverizar el tejido utilizando una mano de mortero. Permitir que el nitrógeno líquido se evapore.

  3. Pasar la muestra a un microtubo libre de RNAsas (no suministrado) y añadir 400 l de Tampón de Lisis RNA . Homogenizar pasando el lisado 5 o 10 veces a través de una jeringa con una aguja de 25 o con un homogenizador eléctrico de mano.

  4. Centrifugar durante 2 minutos para pellet algún desecho celular que pueda quedar. Pasar el sobrenadante a un microtubo libre RNAsas nuevo (no suministrado).IMPORTANTE: Anotar la cantidad de sobrenadante/lisado.

  5. Añadir un volumen igual de Etanol 70 % que el volumen del lisado.Mezclar por vortex durante 10 segundos.

  6. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  8. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 7.

  9. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  10. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  11. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  12. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  13. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  14. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  15. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.


2.4 Protocolo de extracción de ARN total a partir de sangre

Nota: Se recomienda no utilizar más de 100 l de sangre total y que se haya utilizado EDTA como anticoagulante.


  1. Transferir 100 l de sangre no coagulada a un microtubo libre RNAsas (no suministrado).

  2. Añadir 350 l de Tampón de Lisis RNA a la sangre. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse que la mezcla está transparente antes de proceder con el siguiente paso.

  3. Añadir 200 l de etanol 95-100% al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos.

  4. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  5. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  6. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 5.

  7. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  8. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  9. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  10. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  11. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  12. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  13. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.



2.5 Protocolo de extracción de ARN total a partir de bacterias.

Nota: Se recomienda no utilizar más de 1 x 109 células /ml, el crecimiento bacteriano puede ser medido por un espectrofotómetro, como regla general, un cultivo de E.coli de 1 x 109 células /ml tiene una DO 600 de 1.0.

Preparar una cantidad apropiada de TE conteniendo lisozima, esta solución se preparará con TE libre de RNAsas y conservado en hielo hasta su uso. Para Gram-negativos la concentración de lisozima será de 1 mg/ml y Gram-positivos la concentración de lisozima será de 3 mg/ml.




  1. Pellet las células por centrifugación a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm) durante 1 minuto.

  2. Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del TE con la cantidad apropiada de lisozima.Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

  3. Añadir 300 l de Tampón de Lisis RNA y vortex durante 15 segundos.

  4. Añadir 200 l de etanol 95-100% al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos.Asegurarse que el pellet es completamente disuelto antes de proceder con el siguiente paso.

  5. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  6. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  7. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 6.

  8. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  9. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  10. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  12. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  13. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  14. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.


2.6 Protocolo de extracción de ARN total a partir de levaduras

Nota: Se recomienda no utilizar más de 107 células de levadura o 1ml de cultivo.

Preparar una cantidad apropiada de Tampón de Resuspensión que contenga liticasa : 50mM tris, pH 7.5, 10 mM EDTA, 1M Sorbitol, 0.10 % -mercaptoetanol y 1 unidad / l de liticasa. Esta solución debería prepararse con reactivos estériles y libres de RNAsas y mantenida en hielo hasta ser utilizada.




  1. Pellet las levaduras por centrifugación a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm) durante 1 minuto.

  2. Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del Tampón de Resuspensión con la cantidad apropiada de liticasa.Incubar a 37ºC durante 10 minutos.

  3. Añadir 300 l de Tampón de Lisis RNA y vortex durante 15 segundos.

  4. Añadir 200 l de etanol 95-100% al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos. Asegurarse que el pellet es completamente disuelto antes de proceder con el siguiente paso.

  5. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  6. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  7. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 6.

  8. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  9. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  10. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  12. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  13. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  14. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.


2.7 Protocolo de extracción de ARN total a partir de tejidos vegetales.

Nota: Se recomienda no utilizar más de 30 mg de tejido o 5 x 106 células de plantas.

Tejidos frescos o congelados pueden ser utilizados para este procedimiento.Los tejidos deberían congelarse



en nitrógeno líquido y transferidos inmediatamente a -70ºC. Cuando aislamos ARN de tejidos congelados asegurase que no desciende mucho su temperatura durante el pesaje y la pulverización con una mano de mortero para asegurarse que la integridad del ARN no se compromete.


  1. Colocar el tejido o células en un mortero que contenga un cantidad apropiada de nitrógeno líquido para cubrir la muestra. Pulverizar el tejido utilizando una mano de mortero. Permitir que el nitrógeno líquido se evapore.

  2. Pasar la muestra a un microtubo libre de RNAsas (no suministrado) y añadir 400 l de Tampón de Lisis RNA . Homogenizar con un homogenizador eléctrico de mano.

  3. Centrifugar durante 2 minutos para pellet algún desecho celular que pueda quedar. Pasar el sobrenadante a un microtubo libre RNAsas nuevo (no suministrado). IMPORTANTE: Anotar la cantidad de sobrenadante/lisado.

  4. Añadir un volumen igual de Etanol 70 % que el volumen del lisado.Mezclar por vortex durante 10 segundos.

  5. Ensamblar una Columna de RNA con un tubo de recogida que se suministra.

  6. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto.

  7. Eliminar el microtubo de recogida y ensamblar la Columna de RNA con un nuevo tubo de recogida. Dependiendo del volumen del lisado repetir el punto 7.

  8. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo la solución de lavado ha pasado a través de la columna , sino fuera así centrifugar otro minuto adicional.

  9. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto.

  10. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Solución de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minuto adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida.

  11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.

  12. Añadir 50 l de Tampón de Elución RNA a la columna.

  13. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox. 2.000 rpm), seguido de 1 minuto a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a 14.000 x g (aprox. 14.000 rpm).

  14. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos dias. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos.



3. GUIA DE PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Dado el amplio número de muestras que pueden ser tratadas para extraer ARN total utilizando este kit, es difícil hacer una generalización de problemas, recomendamos ponerse en contacto con el servicio técnico de DANAGEN-BIOTED para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que puedan surgir durante el trabajo. info@danagen.es


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