Chemotaxonomické studie Magnolia tripetala, M. obovata a jejich křížence

Hybridní původ více než 120 jedinců pěstovaných v Průhonickém parku je podpořen jak morfologicky (intermediarita znaků), tak isoenzymově (detekovatelná heterozygotnost). Díky isoenzymové analýze je známa i genetická variabilita těchto rostlin (předpoklad stejných společných rodičovských rostlin, stejného stupně ploidie). Rostliny k analýzám být použity mohou (podle dendrologa parku J. Burdy je třeba porosty zmladit jejich prořezáním). Využít lze i M. obovata rostoucí v botanické zahradě UK v Praze (svolení ředitele V. Větvičky) a arboretu Kostelec nad Černými Lesy (svolení správce V. Bažanta), zdrojem materiálu M. tripetala může být případně 10 rostlin ze sídliště Malešice a dále stejná místa jako u M. obovata (rostliny jsou pěstovány ve stejných objektech), případně i několik rostlin ze soukromých zahrad (M. tripetala je pěstována častěji).

2) jak lze elektroforeticky detekovat mobilitu a aktivitu enzymu katalyzujícího vznik magnololu a honokiolu

b) HPLC analýza obsahu fenylpropanoidů (magnolol, honokiol, obovatol) dle Tsai 1992.

V ČR jsou tito zástupci a jejich kříženec vzácněji pěstováni také. Rodičovské druhy jsou v introdukcích někdy zaměňovány (ZOO a BZ v Plzni, do r. 2003 botanická zahrada PřF UK v Praze), jejich determinační znaky však již byly prověřeny a taxonomická příslušnost některých pěstovaných rostlin ověřena i pomocí isoenzymové analýzy (v rámci diplomové práce).

Čeleď magnóliovitých byla v uplynulých letech z hlediska obsahových látek intenzívně zkoumána, Hegnauer 1990. Asijští zástupci sekce Rytidospermum (zejména M. officinalis a M. obovata) jsou významnými léčivými rostlinami používanými v tradiční asijské medicíně již po celá tisíciletí (Shennong Bencao Jing popisuje léčivé vlastnosti M. officinalis již kolem r. 100 n. l., Yang 1998 sec. Dharmananda 2003, Yang 1998 sec. Derrida 2003). Význam pro tradiční medicínu je nesporný (roční produkce sušené v kůry v Číně dosahuje 200 t a při zvýšené poptávce v zahraničí existuje projekt provincie Zhejiang na zvýšení produkce na 1500 t, Si Jinping 2000 sec. Dharmananda 2003, ve volné přírodě byla M. officinalis a její var. biloba kvůli loupání jejich kůry vyhubeny a M. rostrata je ohroženým druhem, Hunt 1998) a perspektivní se jeví i využití v medicíně moderní (zejména psychofarmakologie, Patočka 2002). Cortex magnoliae officinalis (magnolia bark) je dnes v nabídce mnoha farmaceutických firem (informace online např. TenzingMomo, Herbasin, Select Oils Inc., Hunan Kinglong Bio-resources Products industry Co.,Ltd, NL Acupuncture & Herbal Supplies Ltd., SinoHerbKing Inc....) a součástí různých léčivých směsí, Dharmananda 2003.

Farmakologický význam mají především isomerní diphenyllignanoidy magnolol (5,5´-di-2-propenyl-1,1´-biphenyl-2,2´-diol) a honokiol (3´5-di-2-propenyl-1,1´-biphenyl-2,4´-diol), (účinná centrální myorelaxancia, silné antioxidační účinky, protizánětlivý účinek, účinek na centrální cholinergní nervový systém, anxiolytický účinek srovnatelný s efektem benzodiazepinů ovšem bez jejich nežádoucích účinků; 1. isolace magnololu Sugii 1930 sec. Ito 1982, honokiolu Fujita 1972) a biphenyletherlignanoidy např. obovatol (4',5-diallyl-2,3-dihydroxybifenylenther; inhibice acyl-CoA-cholesterylesterázy; 1. isolace Ito 1982), Patočka 2002. U magnóliovitých lze rozlišit 11 hlavních skupin lignanoidů (lignanoidy=lignany+neolignany), Hegnauer 1990. Kůra M. officinalis a M. obovata obsahuje magnolol a honokiol v různých poměrech a jako hlavní fenolické sloučeniny, Hattori 1986 (obsah magnololu a honokiolu v kůře čínských vzorků se pohybuje v rozmezí 2-11% a 0,3-4,6%, Tang 1992, Zhu 1998 sec. Dharmanda 2003). Právě různé poměry a množství těchto látek by mohly nést chemotaxonomicky významnou informaci (i za předpokladu značné ovlivnitelnosti jejich obsahu prostředím, viz. charakteristika materiálu). U M. tripetala v souvislosti s obsahovými látkami dosud nebyla publikována žádná významnější práce zahrnutá např. do databáze Web of Science. Obsah farmakologicky významných látek u tohoto druhu lze však předpokládat díky evoluční příbuznosti k ekonomicky a farmakologicky významným zástupcům, obsah magnololu a honokiolu u ni zmiňuje Hegnauer 1990, El-Feraly 1978 sec. Hattori 1984 a antibiotické účinky u tohoto druhu prokázal i Kabelík 1972, který doporučil i její využití např. do kolínských vodiček. Lignanoidy mohou být významné i ekologicky (přirozená ochrana proti patogenům - antibiotické účinky látek kůry magnólií potvrdil např. Ito 1982, Zhu 1998 sec. Dharmanda 2003, Kabelík 1972, antifungicidní aktivitu proti některým patogenním plísním Bang 2000, Hwang 2002 sec. Patočka 2002, fenolické látky se obecně mohou uplatňovat i např. u nepřímé alelopatie, Procházka 1998, ekologicky významná může být i poněkud delší doba jejich rozkladu (pomalá dekompozice rozměrných listů). Magnolol a honokiol jsou také součástí vonných esencí (jemná vůně, Dharmanda 2003, magnolol však nepatří mezi éterické oleje, Hegnauer 1969).

Nejen z vědeckého hlediska by mohlo být zajímavé srovnávací studium obsahových látek u M. obovata (obsahové látky jsou dobře známy), M. tripetala (patrně málo studií) a jejich křížence (dosud neanalyzován).

Chemotaxonomické studie s identifikací spekter variability obsahových látek mohou podpořit pozdější případné hypotézy hybridního původu pěstovaných rostlin (Hsiao 1973). Zajímavé by rovněž mohlo být srovnání závěrů studia alkaloidů s Furmanowa 1980 (rovněž srovnávací chemotaxonomická studie mj. M. obovata a M. tripetala v introdukčních podmínkách). Metodika chemické isolace, analýzy a fyzikálněchemické vlastnosti analyzovaných látek jsou již velmi dobře zpracovány a známy - honokiol a magnolol např. Maruyama 1998, Zhang 1997, Tsai 1992, Namba 1982, Ito 1982, Fujita 1972, obovatol Ito 1982.

2. Jaké jsou koncentrace honokiolu, magnololu a obovatolu v kůře a listech u studovaných taxonů, existují zásadní taxonomické rozdíly v poměru obsahu těchto látek v kůře a listech?

3. Existuje variabilita v obsahu analyzovaných látek mezi jednotlivými rostlinami (zejména průhonických kříženců), souvisí tato variabilita s variabilitou genetickou či stupněm hybridizace u křížence?

Analýza přispěje k chemotaxonomickému srovnání M. tripetala, M. obovata a jejich křížence. Srovnání obsahu lignanoidů může být významné i z hlediska evolučního (blízce příbuzné druhy s krátkou dobou divergence a amfipacifickým rozšířením). Významné bude i poznání způsobu dědičnosti analyzovaných látek u kříženců a zhodnocení variability jejich obsahu mezi jednotlivými rostlinami (korelace s genetickou variabilitou). Analýza a zhodnocení obsahu fenolických látek má význam i pro případnou aplikaci těchto poznatků v oblasti ekologie rostlin (např. přirozená ochrana proti patogenům, alelopatie, doba rozkladu listů). Z hlediska zkvalitnění výuky příslušných oborů na PřF UK a odbornému růstu členů řešitelského týmu lze spatřovat cíl projektu rovněž v aplikaci souboru metodických přístupů dosud na katedře botaniky na studium dřevin neaplikovaných.

Daná studie má i výjimečné a dobré předpoklady ke svému uskutečnění - Magnolia tripetala x obovata se ve volné přírodě nevyskytuje, pěstována je velmi omezeně (v Průhonickém parku porosty více než 120 vzrostlých analyzovatelných rostlin majících předpokládané stejné rodičovské rostliny), základní taxonomické studie analyzovatelného rostlinného materiálu již byly provedeny (vyloučení záměn taxonů, částečně známá genetická variabilita i původ rostlin, introgresi u rostlin pěstovaných rodičovských druhů lze vyloučit).
Způsob řešení:

Jedná se o práci experimentálního zaměření, dosažení výše uvedených cílů zahrnuje tyto kroky:

Zdrojem materiálu budou zejména rostliny pěstované v Průhonickém parku, Botanické zahradě PřF UK v Praze, Arboretu ČZU v Kostelci nad Černými Lesy a na sídlišti v Malešicích. Zatímco u kříženců v Průhonickém parku je k dispozici pro analýzy téměř neomezené množství materiálu (přes 120 vzrostlých stromů /starých přes 50 let/, některé jsou již určeny k prořezání, množství dostupného materiálu umožňuje i případnou optimalizaci analýzy), u rodičovských druhů bude odebráno jen nezbytné množství materiálu, aby rostliny byly co nejméně poškozeny (cca 1 větev). Obvyklou dobou sběru kůry je 5.5-20.6, Hu 2000.

Metodika této analýzy byla v rámci diplomové práce již optimalizována a přinesla první výsledky (enzymové systémy LAP, PGDH, ADH, AAT, EST). Analýza však byla provedena u omezeného počtu rostlin a původní rodičovské rostliny se dosud nepodařilo jednoznačně určit. K chemotaxonomickému srovnání by měly být použity i další rostliny (např. i kříženci předpokládané F2 generace ze ZOO Praha) a genetická variabilita by měla být známa co nejlépe (použití dalších enzymových systémů). V bodě *X navrhován i vývoj nového enzymového systému.

Extrakce (obvykle je sušená kůra extrahována v n-hexanu, ethanolu či etheru) a analýza magnololu a honokiolu bude provedena podle Tsai 1992 (metoda HPLC s UV detekcí), event. Zhang 1997 (kapilární elektroforéza s UV detekcí) či Namba 1982 (TLC). Determinace těchto látek může být provedena i na základě jejich fyzikálněchemických vlastností popsaných např. v Maruyama 1998. Standard magnololu lze připravit i syntézou z chavikolu podle Erdtman 1957 či z 2,2´-dimethoxy-5,5´-dibromo-diphenylu podle Runeberg 1958. Analýzu obsahu obovatolu (i obovatalu) lze provést podle Ito 1982 (TLC).

Získaná chromatografická spektra jednotlivých taxonů budou srovnána. Druhově specifické látky budou pokud možno identifikovány na základě svých fyzikálněchemických vlastností. Stanoveny budou zejména přesné koncentrace honokiolu a magnololu, popř. obovatolu (farmakologicky a patrně i ekologicky významné látky) a srovnány rozdíly v koncentraci mezi jednotlivými taxony, rostlinami (variabilita obsahu konfrontovaná s variabilitou genetickou, stanovenou isoenzymovou analýzou) a částmi rostlin (kůra, listy).

V rámci diplomové práce byla provedena zkouška použitelnosti SHDH pro PAGE pro magnólie sect. Rytidospermum, tento systém se však nepodařilo optimalizovat a pro další genetické studie použit nebyl. Z výsledků jiných enzymových systémů však vyplívá genetická variabilita daná sourozeneckým vztahem u průhonických F1 kříženců, provedena byla i základní studie genetické variability u pěstovaných rostlin rodičovských druhů. Analýza obsahu fenylpropanoidů magnólií dosud v ČR provedena nebyla (realizace viz. chemotaxonomické studie níže), vliv prostředí na variabilitu obsahového složení také zřejmě zkoumán nebyl. Některé větve více jedinců kříženců v Průhonicích mají stejnou tloušťku, polohu a pozici ke slunci a je tedy možno srovnat koncentrace studovaných látek (měly by být stejné, pokud se jedinci neliší genotypově v kritických enzymových systémech x dalších systémech ovlivňujících např. koncentraci substrátu pro kritické studované enzymy /ideální by byla situace s genotypově stejnými jedinci, lišícími se jen v 1 kritickém isozymu a pěstovaných v identických podmínkách - prostředí může ovlivňovat např. potřebu látek v jednotlivých buňkách, konkrétněji např. vlhčí prostředí může zvyšovat koncentraci antifungicidních fenylpropanoidů v kůře, neboť zde je větší pravděpodobnost napadení houbovými organizmy/). Mezidruhové srovnání je možno také udělat, jedinci různých druhů jsou ovšem někdy spíše pěstovány v nesrovnatelných podmínkách.

Harmatha J. (2002); Fenylpropanoidy, lignany a jejich biologické účinky; Chemie a biochemie přírodních látek. Cyklus organické chemie, svazek 27: 117-142; ÚOCHB-AVČR, Praha

ExPASy (2003); [Molecular Biology Server]; URL: http://www.expasy.org/cgi-bin/show_image?D3 [2003-10-31]

GenomeNet (2003a) [servis Institute for Chemical Research, Kyoto University]; URL: http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.25 [2003-10-31]

GenomeNet (2003b) [servis Institute for Chemical Research, Kyoto University]; URL: http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/show_pathway?MAP00400+1.1.1.25 [2003-10-31]

Citovaná literatura:
 Azuma H., Garcia-Franco J. G., Rico-Gray V. et Thien L. B. (2001): Molecular phylogeny of the Magnoliaceae: the biogeography of tropical and temperate disjunctions; American Journal of Botany 88: 2275-2285.

 Bang K. H., et al. (2000); Antifungal activity of magnolol and honokiol; Archives Pharmaceutical Research 23 (1): 46-49

 Dharmananda S. (2003) [online]: Magnolia bark; URL: http://www.itmonline.org/arts/magnolia.htm [2003-06-08]

 Derrida M. (2003) [online]: Twolobed Officinal Magnolia Bark Extract; URL: http://www.nanotech.com.cn/cgi-bin/hbv/messages/743.html [2003-12-04]

 El-Feraly F. S., Li W. (1978); Lloydia 41: 442

 Erdtman H., Runeberg J. (1957); Phenol dehydrogenations: dehydrogenation of chavicol to magnolol; Acta Chem. Scand. 11: 1060

 Fujita M., Itokawa H., Sashida Y. (1972); Honokiol, a new phenolic compound isolated from the bark of Magnolia obovata Thunb.; Chem. Pharm. Bull. 20 (1): 212-213

 Furmanowa M., Jozefowicz J. (1980); Alkaloids as taxonomic markers in some species of Magnolia and Liriodendron ; Acta Societatis Botanicarum Poloniae 49: 527-535

 Hattori M, Sakamoto T., Endo Y., Kakiuchi N., Kobashi K., Mizuno T., Namba T. (1984); Metabolism of magnolol from Magnoliae Cortex I; Chem Pharm. Bull. 32 (12): 5010-5017

 Hegnauer R. (1969); Chemotaxonomie der Pflanzen 5 (Magnoliaceae-Quiinaceae); Birkhäuser Verlag, Basel und Stuttgart

 Hegnauer R. (1990); Chemotaxonomie der Pflanzen 9 (Magnoliaceae-Zygophyllaceae); Birkhäuser Verlag, Basel, Boston und Stuttgart

 Hsiao J.Y., Li H.L. (1973); Chromatographic studies on the Red Horsechestnut (Aesculus x carnea) and its putative parent species; Brittonia 25: 57-63

 Hu S.Y. (2000); The Economic botany of Magnoliaceae In: Liu Y., Fan H., Chen Z., Wu Q., Zeng Q. eds. (2000); Proceedings of the international symposium on the family Magnoliaceae; Science Press, Beijing, China: 38-43

 Hunt D. (1998): Magnolias and their allies. - ed. The International Dendrology Society and the Magnolia Society, Milborne Port.

 Hwang EI., Kwon BM, Lee SH, Kim NR, Kang TH, Park BK, Kim SU (2002); Obovatols, new chitin synthase 2 inhibitors of Saccharomyces carevisiae from Magnolia obovata; J. Antimicrob. Chemother 49: 95-101

 Ito K., Asai S-I. (1974); Studies on the alkaloids of Magnoliaceous Plants XXXX-Alkaloids of Magnolia obovata Thunb. on the bases of leaves and roots; Yakugaku Zasshi 94 (6): 729-734

 Ito K., Iida T., Ichino K., Tsunezuka M., Hattori M., Namba T. (1982); Obovatol and obovatal, novel biphenyl ether lignans from the leaves of Magnolia obovata Thunb; Chem. Pharm. Bull. 30 (9): 3347-3353

 Ishida K., Yoshimaru H., Ito H. (2003); Effects of geitonogamy on the seed set of Magnolia obovata Thunb. (Magnoliaceae); Int. J. Plant Sci. 164(5):729–735

 Kabelík J. (1972): Antibiotika magnolií (Magnoliaceae). - Vlastivědný ústav Olomouc.

 Kim S., W. C. Mark, C. R., Parks (2001): Phylogentic relationships in family Magnoliaceae inferred from ndhF sequences. - American Journal of Botany 88: 717-728.

 Maruyama Y., Kuribara H., Morita M., Yuzurihara M., Weintraub S. T. (1998); Identification of magnolol and honokiol as anxiolitic agents in extracts of Saiboku-to, an oriental herbal medicine; J. Nat. Prod. 61: 135-138

 McDaniel J. C. (1980); Wilson's Magnolias in America; Magnolia 16 (2): 27-30

 Namba T., Tsunezuka M., Hattori M. (1982); Dental caries prevention by traditional chinese medicines Planta Medica 44: 100-106

 Patočka J., Strunecká A., Jakl J. (2002); Magnolie mohou být nejen krásné, ale i užitečné; Psychiatrie 6 (4): 247-251

 Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J. a kol. (1998); Fyzilogie rostlin; Academia Praha

 Qiu Y.-L., Chase M. W., Parks C. R. (1995); A chloroplast DNA phylogenetic study of the eastern Asia-eastern North America disjunct section Rytidospermum of Magnolia (Magnoliaceae); American Journal of Botany 82: 1582-1588

 Runeberg J. (1958); Phenol dehydrogenations VIII: Synthesis of magnolol; Acta Chem. Scand. 12: 188

 Savage B. F. (1980); Wilson Magnolias in Britain; Magnolia 16(2):31-36

 Si Jinping (2000); Jingning Magnolia officinalis development project; Jingning science and technology development department, Zhejiang, China

 Sugii Y. (1930); Yakugaku Zasshi 50: 193

 Svoboda A. M. (1981); Introdukce okrasných listnatých dřevin; Studie ČSAV č. 12; Academia

 Tang W., Eisenbrand G. (1992); Chinese drugs of plant origin; Springer-Verlag, Berlin

 Tsai T.H., Chen Ch.F. (1992); Identification and determiation of honokiol and magnolol from Magnolia officinalis by high-performance liquid chromatography with photodiode-array UV detection; Journal of Chromatography 598: 143-146 online zde

 Vašák E. (1973): Magnolia hypoleuca in nature and in cultivation. - Newsl. Am. Magnolia Soc. 9 (1): 3-6.